目的:　　 对胚胎干细胞(ESC)分离培养的研究，旨在摸索适合昆明小鼠ESC分离培养的方法，以提高昆明小鼠ESC的建系率。　　 方法:　　 本试验分为两部分:饲养层的制备以及KMmESC的分离培养。饲养层包括MEF饲养层和bBMSC饲养层。对MEF饲养层的制备采用两种方法:先消化离心，长满后采用MMC处理，然后用PBS-清洗后用做饲养层;另一种方法是MMC处理后，消化离心接种贴壁后做饲养层。bBMSC饲养层采用长满后用MMC处理0h、0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，选取合适的处理时间段，PBS-清洗后直接用做饲养层，并比较了MEF饲养层与最佳时间段处理的bBMSC饲养层用做分离ESC的效果。　　 在试验中选用了三种不同发育阶段的胚胎（桑葚胚、囊胚和孵化囊胚）来进行分离培养ESC，并比较了初步增殖ICM与完全增殖ICM对ESC分离培养的效果。选取三种胰酶+EDTA组合（0.25％胰酶-0.04％EDTA、0.20％胰酶-0.04％EDTA和0.02％胰酶-0.04％EDTA），选取较好效果的酶浓度，然后分别采用机械分离、一次消化法、连续消化法、连同饲养层一起消化法以及机械分离+酶消化法五种方法分离ICM和ESC集落，比较五种方法对昆明小鼠ESC分离培养的影响。并且对分离筛选的ESC集落进行碱性磷酸酶(AKP)检测、核型分析和体外分化潜能的检验。　　 结果:　　 1、丝裂霉素C(MMC)处理bBMSC1h、1.5h、2h时效果较好，三个时间点无明显差异(P＞0.05)。小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)作为饲养层细胞时与bBMSC作为饲养层细胞时获得5代ESC的效果相比差异不显著(P＞0.05)。　　 2、采用0.02％胰酶-0.04％EDTA消化的第二代ESC克隆率最高，所传代数最高，效果较好，适合用于分离培养ESC。　　 3、0.02％胰酶-0.04％EDTA浓度下，采用连续消化法对ESC进行传代的效果最好，传至5代的效率最高。　　 4、贴壁后初步增殖（贴壁后24h）的ICM与贴壁后充分增殖（贴壁后72-96h）的ICM在获得ICM率方面、分离昆明ESC的效果方面差异显著。早期增殖ICM(94.6％，21.6％)要显著高于充分增殖的ICM(81.3％，10.4％)。　　 5、不同发育阶段的胚胎对ESC分离培养有很大的影响。孵化囊胚的与囊胚和桑葚胚相比差异显著。　　 6、ESC之间能够相互附着，具有自发形成ES集落的能力。　　 7、所得ES集落AKP检测呈阳性，核型正常，能够分化为多种类型的细胞。