论文部分内容阅读
桑树黄化型萎缩病是由植原体引起的一种桑树毁灭性病害,严重影响了蚕业生产的发展。目前有关植原体致病的分子机制仍不清楚。植物的miRNA作为一种重要的调控因子,在植物的生长发育、信号转导以及环境响应等方面都扮演着十分重要的角色。本研究利用PCR技术克隆得到3个桑树响应植原体侵染的新miRNAs (mul-miRn8、 mul-miRn26和mul-miRn33)基因,并对其生物学功能进行了研究,初步明确了这3个miRNAs在植物响应逆境胁迫过程中的作用,为揭示基于miRNA水平上的桑树响应植原体侵染的调控机制奠定了基础,对于促进桑树功能基因组学研究及丰富和发展miRNA的生物学功能具有重要意义。本文的主要研究结果如下：(1)桑树响应植原体侵染的新miRNAs的表达差异显著性验证根据桑树转录组高通量测序得到的3个响应植原体侵染的新miRNAs的基因序列,利用Northern blot和荧光定量PCR的方法对其在受植原体侵染叶片和健康桑树叶片中的表达差异显著性进行了验证。结果显示,桑树受植原体侵染后,mul-miRn8的表达量显著上升,mul-miRn26和mul-miRn33的表达量均显著降低。(2)桑树响应植原体侵染的新miRNAs基因在拟南芥中的异源表达分析根据已有的桑树转录组序列信息,通过PCR技术克隆得到mul-miRn8、mul-miRn26和mul-miRn33的基因,分别命名为MulMIRn8、MulMIRn26和MulMIRn33,构建了其植物表达载体,并成功转化了拟南芥,获得了转基因植株。通过Northern杂交分析发现MulMIRn8、MulMIRn26和MulMIRn33基因均能在转基因拟南芥植株中高效表达；通过对mul-miRn8、mul-miRn26和mul-miRn33成熟体的荧光定量PCR检测发现,高效表达的3个mul-miRNAs基因均能够在转基因拟南芥中加工形成成熟体。(3)桑树响应植原体侵染的新miRNAs的生物学功能分析为了研究桑树响应植原体侵染的3个新niRNAs的生物学功能,我们对转MulMIRn8、MulMIRn26和MulMIRn33基因拟南芥分别进行了非生物胁迫(干旱和盐胁迫)和生物胁迫(丁香假单胞杆菌番茄致病变种Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, Pst DC3000侵染)处理,结果发现：与野生型植株相比,转MulMIRn8拟南芥具有较强的抗Pst DC3000侵染能力和抗干旱胁迫的能力,但抗盐能力与野生型植株无明显差别；与野生型植株相比,转MulMIRn26拟南芥对于干旱胁迫和Pst DC3000侵染均表现出一定的抗性,但对盐胁迫敏感；转MulMIRn33拟南芥虽然具有较强的抗干旱胁迫、盐胁迫能力,但对Pst DC3000侵染却表现为较敏感。因此,桑树响应植原体侵染的3个新miRNAs在植物响应逆境胁迫过程中均具有一定作用,但其生物学功能具有明显差别。(4)桑树新miRNAs靶基因的生物学功能分析为了进一步研究桑树响应植原体侵染的3个新miRNAs的作用机制,我们利用生物信息学技术对3个miRNAs的靶基因进行预测,发现nul-miRn8的靶基因MulBAH1是一种BAH结构域蛋白；mul-miRn26的靶基因MulZF1是一种含CCCH结构域的锌指蛋白；mul-miRn33的靶基因MulDME1是一种转录激活因子(DEMETER)。利用Northern杂交分析,发现桑树新miRNAs在转基因拟南芥中成功表达后可以通过靶向拟南芥中的靶基因来发挥其基因沉默功能。根据已有的桑树转录组序列信息,通过PCR技术克隆得到MulBAH1和MulZF1基因,构建了其植物表达载体,并成功转化了拟南芥,获得了转基因植株。对转基因植株和野生型植株进行干旱、盐胁迫和Pst DC3000侵染处理,发现转MulBAH1拟南芥植株具有较强的抗盐胁迫的能力,但对干旱胁迫和病原菌的侵染较敏感;而转MulZF1拟南芥植株对于盐胁迫、干旱胁迫和Pst DC3000的侵染均有较强的抗性。因此,响应植原体侵染的3个miRNAs不仅参与响应植原体侵染过程,还同时参与植物的生长发育和多种生物胁迫及非生物胁迫响应过程。