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本研究主要用ISSR技术构建何首乌的DNA指纹图谱；用叶绿体基因组的trnL-F序列和核基因组的ITS序列进行序列比较与变异分析,对何首乌的遗传多样性进行初步研究,对何首乌各居群进行聚类分析,并对何首乌的分子鉴别进行研究,寻找鉴别何首乌与其混伪品的方法,为何首乌的品种分类、物种鉴定、遗传育种和资源保护等提供基础的研究数据,为何首乌良种选育及其基础理论研究打下基础,丰富建立质量控制体系的理论依据。本研究结果主要如下：
(1)通过单因素试验研究,建立了适合何首乌ISSR分析的反应体系和扩增程序,得到了清晰可读的ISSR指纹图谱,为下一步的遗传分析奠定了基础。采用ISSR分子标记技术对14个何首乌居群的遗传亲缘关系与分类进行研究。用4个扩增条带多、多态检出率高的引物,获得56条清晰可辨的ISSR条带,其中多态性带47条,多态性程度达到83.93％；14个居群之间遗传距离的变异范围在0.0164～0.7107之间；根据相似性系数,对何首乌居群进行聚类分析的结果表明,14个供试居群划分为4个类群,并可通过相似性聚类分析直观表现样品间的相似程度。
(2)何首乌14个居群的trnL-F序列长度在955至970bp范围内变化,排序后序列总长度为990bp,当空位始终作缺失处理时,有6个置换变异位点,通过这6个碱基变异位点可以将湖北恩施、宜昌及云南的何首乌鉴别出来,而且可以与广东和广西的样品区别开来,可作为湖北恩施、宜昌及云南何首乌的特异性鉴别位点。
(3)通过UPGMA法构建的基于trnL-F序列系统分支树分为四支,来自广东和广西的全部样品属于Ⅰ分支。湖北恩施和宜昌的样品被分为了Ⅱ和Ⅲ分支,云南的属于分支Ⅳ。由于云南,广东及广西,湖北宜昌和湖北恩施在地理气候上存在一定的差异,说明何首乌可能存在与其地理相关的一些基因型品种,是不同的生态或地理条件长期选择作用的结果。
(4)何首乌14个居群样品ITS-1、5.8S rDNA和ITS-2全序列548bp,其中ITS1序列长度194-195bp,5.8S长164bp,ITS2序列长度为189bp,共有16个位点发生了变异。ITS1的变异位点有6个,ITS2有10个变异位点,5.8S无变异位点。野生种云南的样品YN共有8个位点发生了变异,ITS序列变异最大,表明云南种何首乌变异最大,主要与云南独特的地理气候有关,这与ISSR指纹图谱和trnL-F序列的研究结果一致。
(5)何首乌及其混伪品ITS序列的测得为进行何首乌的基因鉴别和真伪鉴别打下了良好的分子基础。通过测序、碱基差异和同源性比较,能准确地区分何首乌与其混伪品毛脉蓼、翼蓼等,而且DNA测序稳定性强,重现性好结果准确可靠,可作为中药何首乌鉴别的依据。我们的研究结果表明ITS序列是鉴别何首乌和混伪品的理想的分子标记。何首乌