论文部分内容阅读
降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)是一种感觉神经肽,在骨组织中的分布广泛,主要分布于骨代谢活跃的部位,直接或间接地调节成骨细胞和破骨细胞分化及活性。目前的研究表明CGRP在骨折愈合中发挥重要作用。有关CGRP在成骨细胞正常代谢中的具体机制国内外的研究较多,但对细胞蛋白表达的研究较少。本研究寻找与CGRP相互作用、且在成骨愈合过程中起重要作用的蛋白,并且通过免疫荧光等技术确定它们在信号通路中的上下游关系,从而探讨CGRP在骨创伤愈合过程中的可能作用机制。目的:探讨CGRP作用下成骨样细胞MG-63内蛋白质表达谱的变化。方法:传代培养MG-63成骨样细胞,随机分为CGRP组和对照组。通过MTT比色法检测细胞生长曲线并进行统计分析。提取各组MG-63内蛋白质,经双向电泳分离、考马斯亮蓝染色后扫描分析蛋白质表达变化,选取6个差异显著的蛋白点进行胶内酶切、肽质量指纹图谱分析和IPI数据库检索。并对检索出的差异蛋白HRNR Hornerin通过western blot及免疫荧光方法进行验证。结果:1、MTT比色法检测表明,CGRP实验组和对照组细胞生长曲线有显著性差异。2、双向电泳可分离(967±17)个蛋白质,点匹配率为(85.1±1.4)% ,成骨样细胞6种蛋白点出现明显差异表达,与对照组比较,CGRP组6种蛋白质表达下调。3、质谱分析鉴定出核糖体结合蛋白p180(p180/ribosome receptor)及钙结合蛋白HRNR Hornerin等5种蛋白质,前者与核糖体定位和合成的新蛋白转位有关,而后者可影响细胞内钙浓度的。4、通过对HRNR Hornerin的western blot及免疫荧光分析,发现HRNR Hornerin在CGRP实验组中表达显著下降。结论:1、CGRP作用于成骨样细胞(MG-63)后,显著促进MG-63生长,实验组与对照组MTT细胞生长曲线差异显著。2、通过双向电泳,发现CGRP可诱导成骨样细胞(MG-63)6个蛋白点发生表达的差异性明显,说明CGRP可能通过调节蛋白质含量或传导通路的途径发挥细胞调节作用。3、质谱分析技术鉴定出的差异显著的蛋白质可能在CGRP作用下成骨样细胞(MG-63)中发挥着直接或间接的作用。CGRP可能通过这几种蛋白参与第二信使及细胞因子的调节并发挥功能。4、采用western blot及免疫荧光染色方法分析,MG-63培养液加入CGRP作用24h后,细胞质中HRNR Honerin表达降低,证实了质谱分析结果。分析钙离子结合蛋白HRNR Honerin在CGRP作用于成骨样细胞MG-63中发挥着重要作用。CGRP可能通过调节钙离子浓度这一途径促进成骨样细胞MG-63的生长,从而最终在骨折愈合中发挥作用。