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本文介绍了来源于极端微生物的三种极端酯水解酶,来自嗜盐古菌Haloarcula marismortui ATCC43049嗜盐酯酶LipC,来自腾冲嗜热菌Thermoanaerobacter tengcongensis MB4耐热酯酶LipA3和来自AlkahphilicBacillus pseudofirmus OF4嗜碱酯酶EstOF4的异源表达,纯化以及其对极端环境的适应机制的研究。其具体研究结果如下:
一:来自极端嗜盐古菌Haloarcula marismortui ATCC43049的酯水解酶基因LipC在非嗜盐表达体系Escherichia coli BL21中得以重组表达,经过纯化得到等电点为4.0的酸性重组蛋白LipC。MALDI-TOF肽指纹质谱分析确定了重组嗜盐蛋白LipC的正确性,证明了目的蛋白在SDS-PAGE上异常的电泳行为是由于蛋白LipC中过量的酸性氨基酸引起。纯化酯酶LipC的催化活性完全依赖于环境中盐离子浓度,无盐条件可导致酯酶LipC的可逆性失活。在3.4M NaCI和3MKCl条件下,该酶对短链对硝基苯酚酯底物(C2-C12)具有水解活力,最适底物为硝基苯酚乙酸酯,最适合pH和温度分别为9.5和45℃。在其最适合反应条件下该酶的催化动力学常数分别是.Km=0.090±0.006mM,kcat=10.0±0.03 s-1和kcat/Km=111.1s-1·mM-1。
圆二色谱(CD)和荧光色谱研究结果显示在最适盐离子浓度下LipC表现最佳的二级结构和三维构象,在无盐离子条件下该蛋白结构完全崩解。动态光散射DLS和小角度中子散射SANS扫描揭示了pH,温度和盐度对蛋白LipC的分子聚集状态影响。低于55℃条件下,3.4MNaCl对蛋白的热稳定性具有明显的促进作用,但是在高于55℃条件下盐离子加剧蛋白的变性。差示扫描量热仪(DSC)对嗜盐蛋白的热变性温度检测发现,1M NaCl可以将LipC的热解链温度(Tm)从无盐条件下的42.4℃提高到61.4℃。不同的相渗性盐对LipC都具有激活作用,其激活作用遵循了Hofmeister series梯度即:HPO42->SO42->NO3->Cl->acetate->Br->ClO4->SCN-。利用同源建模获得嗜盐蛋白LipC的分子结构,结果显示此蛋白富含的多数极性氨基酸分布在蛋白分子表面,这种结构特点符合典型的嗜盐蛋白的结构,也是保证该蛋白在高渗条件下保持稳定发挥活性的因为。嗜盐酯酶LipC重组表达是此类蛋白首次成功尝试,对该嗜盐酯酶的盐适应性质的研究为此类极端水解酶的应用提供了理论基础。
二:腾冲嗜热杆菌Thermoanaerobacter tengcongensis MB4疑似酯水解酶基因lipA3得到了重组表达,该酶通过热处理和Ni离子螯合层析以及分子筛层析等纯化技术得到电泳纯的重组蛋白LipA3。活性电泳显示该蛋白发挥活性时以单分子形式存在。重组表达的酯酶LipA3在70℃,pH9.5时表现了最佳活力,在60℃该蛋白半衰期长达200min,最适底物为对硝基苯酚己酸酯和三乙酸甘油酯,在最适条件下酶催化活力分别是150U/mg和126U/mg。通过将LipA3的序列和已经发现的十三个细菌来源的酯酶家族序列对比,确定了这个蛋白代表一类新型酯水解酶。按照细菌酯酶家族划分的原则,LipA3所代表家族被命名为FamilyⅩⅣ,这是最新的一个酯酶家族,该家族的酯酶特征保守五肽为"CHSMG"。
三:利用异源重组表达技术对来自嗜碱芽孢杆菌酯酶基因estofA成功的进行了可溶性表达。经过Ni柱亲和层析,分子筛凝胶电泳层析得到了纯化的重组蛋白,目的蛋白的纯化倍数为13倍。对活性蛋白进行分子筛凝胶电泳确定其活性分子以分子量为64KDa的二聚体的方式发挥活性。重组酯酶EstOF4在pH8.5,50℃条件下对短链和中长链酯底物具有水解活力,在最适条件下对对硝基苯酚己酸酯和甘油三乙酯表现的最高活力分别为10U/mg和1.3U/mg。序列比对和结构模拟确定该蛋白属于细菌酯酶第十三家族FamilyⅩⅢ,蛋白分子由六个α螺旋和七个β折叠组成,活性中心为Ser93,Asp190和His220。通过对比EstOF4与相似酯酶序列信息和酶学特征得到两种影响该酶稳定性的关键氨基酸Val194和Asp207,并根据脯氨酸替代原则对这两个位点进行氨基酸突变,突变体蛋白m207和m194&207在45℃半衰期由野生型的15min分别提高到24min和27min；此外与野生型相比,207位的突变还导致了酯酶催化效率kcat/Km的明显增加,由野生型的4.66 min-1·μM-1增加至12.23min-1·μM-1。这一结果证明了利用脯氨酸替代原则对酯酶EstOF4热稳定性改造的可行性。