芽胞杆菌碱性蛋白酶广泛应用于工业生产,在洗涤剂、制革、纺织、食品加工、化妆品、医药和生物化学分析等多种行业发挥重要作用。随着工业化生产的快速发展,对高产优良蛋白酶的需求日益增加,因此,发掘新的芽胞杆菌碱性蛋白酶并通过基因工程和蛋白质工程加以改良势在必行。本研究以选育的芽胞杆菌碱性蛋白酶为研究对象,利用生物化学与分子遗传手段鉴定蛋白酶的基因与功能,并通过建立枯草芽胞杆菌基因高效表达系统和体外分子定向进化技术改造已有的酶基因,同时构建基因表达工程菌,从结构和功能上鉴定突变蛋白,从而获得芽胞杆菌高产菌株和高效稳定的枯草芽胞杆菌工程菌,进一步得到性能优良的碱性蛋白酶。　　 本研究首先利用基因工程技术构建大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭表达载体pWBSST385,利用表达载体分别在大肠杆菌和枯草芽胞杆菌中克隆表达多种碱性蛋白酶基因,建立碱性蛋白酶基因高效外分泌表达系统。　　 分离鉴定多种产碱性蛋白酶的芽胞杆菌,发现一株碱性蛋白酶高产菌株Bacillus sp.B001。该芽胞杆菌1L摇瓶发酵30 h酶活产量达到34277U/mL。分别采用SDS-PAGE、酶谱法和MALDI-TOF/TOF法鉴定Bacillus sp.B001分泌的胞外碱性蛋白酶AprB,并建立AprB分离纯化方法。该酶在20-90℃、pH5-13的条件下具有蛋白水解活性,最适温度为60°C,最适pH值为10。蛋白酶AprB能够稳定于pH5-12和50℃以下,具有抗表面活性剂和氧化剂能力,显示出重要的工业应用潜力。综合利用SDS-PAGE、MALDI-TOF/TOF、Degenerate PCR和Reverse PCR技术,克隆获得碱性蛋白酶AprB基因,蛋白序列比对结果显示AprB与高碱性蛋白酶(High-alkaline proteases)类蛋白的相似性最高(63.2％)。　　 为进一步研究碱性蛋白酶AprB的结构.与功能特征,将碱性蛋白酶重组外分泌表达于枯草芽胞杆菌中,建立重组表达酶的分离纯化方法。酶学功能测定显示重组表达蛋白与菌株B001产生的蛋白酶AprB具有相似的酶学特性；动力学参数显示AprB具有高水解速率和转化力,对二二种蛋白亲和性依次为偶联酪蛋白>酪蛋白>AAPF。同源建模构建AprB的蛋白结构,通过与同源蛋白比较发现,高碱性蛋白酶类的AprB与M-protease相似,均含有较高R/(R+K)值、较多精氨酸离了对、较大疏水表面面积和表面暴露的Asp催化中心。推测这些特征可能与AprB的耐碱机制有关。此外,研究发现AprB分子表面富含天冬氨酸和谷氨酸残基,正负电荷氨基酸残基比值较低,这些特性与Subtilisin family的M-protease、Subtilisin BPN’及其它已知蛋白酶结构明显不同。　　 最后,本研究通过易错PCR和DNA shuffling技术,建立了一套碱性蛋白酶基因随机突变的方法,以获得性能优良的碱性蛋白酶。利用本研究构建的穿梭表达质粒pWBSST385在枯草芽胞杆菌表达体系中建立碱性蛋白酶突变库,分别采用酪素平板和96孔酶标板两轮筛选法,从20659个突变中高通量鉴定蛋白突变酶,成功获得低温酶活力提高和热稳定性提高的4个蛋白突变酶。为了研究突变蛋白的功能与结构关系,运用定点突变方法详细地分析蛋白突变酶G12的突变位点,结果表明前导肽序列的M25K突变对低温活性起着重要作用。　　 本研究结果表明芽胞杆菌碱性蛋白酶的筛选鉴定、克隆表达与分子定向进化研究为工业酶制剂生产提供了新的高产菌种和新型酶资源,为碱性蛋白酶结构.功能研究提供了新的结构信息,为蛋白酶结构.功能关系研究提供了理论依据,也为蛋白分子定向进化提供了新的研究途径和研究基础。