前言 1 型糖尿病是由于胰岛β细胞自身免疫损伤导致的胰岛素绝对缺乏的一种代谢障碍性疾病，通过基因转移技术将人胰岛素原基因导入糖尿病患者体内以产生长期、稳定、按生理模式分泌的胰岛素，从而可达到永久治疗的目的。因此基因转移载体的选择对糖尿病的基因治疗至关重要。 逆转录病毒载体pLXSN来源于Moloney小鼠白血病病毒(MoMLV)，与携有人突变的胰岛素原基因质粒的PMD18-T载体具有共同的酶切位点，从而可作为载体运用分子生物学实验技术与人突变的胰岛速原基因重组构成新质粒。 本实验的目的是 1：掌握基因重组技术及鉴定方法。 2：构建重组的逆转录病毒载体，为糖尿病基因治疗的进一步试验奠定基础。 材料与方法 1．测序鉴定突变的人胰岛素原cDNA。 2．逆转录病毒表达载体的构建： (1)Hpa Ⅰ，BamH Ⅰ双酶切pLXSN。 (2)Sal Ⅰ酶切携有人突变的胰岛素原基因(MpINS)的PMD18-T载体，3末端平滑并将其5末端磷酸化(BKL)后，用BamH Ⅰ酶切。 (3)琼脂糖凝胶电泳，回收(1)和(2)中5kb和400bp的目的基因片段。 （3）用 TaKaRa DNA ligation kit将回收的（1）（2）片段连接成pLXSN＊MpINS o K）连接物转化感受态细胞HB 101。 K）筛选阳性克隆，提取质粒。 3·PLXSN－MPINS重组体的鉴定： 门严CR鉴定重组体。 （2）EcoR和 BamH酶切鉴定。 实验结果 1．突变的人胰岛素原CDNA测序结果见后。 2．突变的人胰岛素原质粒逆转录病毒载体重组质粒的构建： （1）Hpa＼BamH分别对应在p以SN（5．gkb）的 1477hp ＃149fop的位点，双酶切pLXSN后，电泳回收得到5860hp的片段，结果见图5。 （2）Sal、BamH分别对应在PMD18－T（2．7kb）的33hP 和452hP的位点，S＊ 酶切携有 MPINS的PMD18－T载体，BKL后再用BamH酶切，电泳回收得到418hp的片段，与标准分子量对照后证实含有MPINS，见图6。 3·PLXSN－MPINS重组体的鉴定： ＊）PCR鉴定重组体：连接物经扩增，电泳后出现清晰条带，见图7。 p）酶切鉴定插人方向：BamH上coR等限制性内切酶酶切得到5860hP和418hP两个片段的为单正向重组体，见图8。 讨 论 逆转录病毒载体（RV）介导的基因转移技术是一种高效的转 ·2·染技术，通过该载体的协助，目的基因进人靶细胞。RV不仅能高效转染，而且能将目的基因整合进宿主菌的染色体中，随着宿主菌的分裂将目的基因传递给下一代，这种技术在基因治疗中很常见。 pLXSN是一种源于MoMLV的新型载体，经重新构建而成，按照结构分是属于带有内部启动子的w。载体。它的结构基因gag，env0 等被删出，而且gag的翻译基因的起始密码子ATG被终止密码子TAG所取代。将5端MOMLV序列用相应的小鼠肉瘤病毒（MOMSV）的序列片段代替，这样就进一步降低了同源重组的概率，使逆转录病毒载体介导的基因转移隐患大大降低，具有较高的安全性。有些学者利用PLXSN载体已成功地报道了对ADA下DNF。凝血因子Vlll等进行了基因转移及表达的研究。 前胰岛素原是在胰岛的p细胞内合成的，前胰岛素原在内质网由于共同转录信号序列被去除而形成胰岛素原，以后进人高尔基器，在前激素转化酶（PC。和PC＊的作用下，裂解出C肽，合成成熟的胰岛素川链和A链的复合体厂体内非p细胞不含PC。和PC。酶，因而不能合成成熟的胰岛素而分泌到细胞外。我们通过分子生物学的基因点突变技术，使人胰岛素原基因的B－C链与C－A链连接处的H元碱变成四元碱，从而可被非p细胞内普遍存在的i n酶所识别和剪切，合成成熟的胰岛素分泌到细胞外，参与糖尿病患者体内糖代谢的调节。而以往糖尿病的基因治疗模型中，虽可测到靶细胞内的胰岛素水平，但因不能分泌到靶细胞外或靶细胞外仅有少量成熟的胰岛素表达，而主要表达为胰岛素原，从而限制了其应用。 本实验利用逆转录病毒pChSN作为载体，与携有人突变的胰岛素原基因的载体PMD18－T具有共同的酶切位点BamHI，用限制性内切酶将两者分别切开，再运用分子生物学重组技术构成新质粒，该质粒既可使逆转录病毒的RNA基因的DNA拷贝稳定整合进被感染细胞的染色体中，使突变的胰岛素原基因稳定羡达胰 ·3·岛素并可将成熟胰岛素分泌到细胞外。从两方面为进一步实验奠定基础。 结 论 1．可运用基因重组技术构建突变的胰岛素原基因逆转录病毒重组体。 2．酶切电泳及PCR鉴定重组体中突变的胰岛素原基因克隆及插人方向正确，构建的新质粒可为进一步试验奠定基础。