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[目 的]中国是全球肺癌发病率和死亡率最高的国家之一,其中云南宣威地区肺癌尤为突出。尽管改炉改灶工程使其发病率和死亡率有所下降,但相较于其他地区仍是最高发地区。有研究显示,生物学因素在区域肺癌发病过程发挥关键作用。本研究旨在期望筛查发现与该地区肺癌生存及预后相关性致病关键基因,并探讨其在体内外生物学效应中的作用及影响,为进一步深入研究其生物信号传导机制,为肺癌临床精准治疗提供理论基础。[方 法]一、区域肺癌差异表达基因的筛选及其生物信息学分析收集昆明医科大学第三附属医院胸外科手术后经病理诊断确诊的宣威地区代表性肺癌9例、非宣威地区肺癌6例,利用Agilent mRNA表达谱芯片测序结果,筛选差异表达基因（Different expressed genes,DEGs）;利用注释及可视化数据库（Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID）工具进行基因本体（gene ontology,GO）功能富集度分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析。利用基因相互作用检索工具（The Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,STRING）数据库进行蛋白网络互作（protein protein interaction network,PPI network）网络分析,利用Cytoscape软件进行具体可视化分析,同时利用该软件内置的插件CytoHubba筛选出核心基因（Hub genes,HB）。最后利用Kaplan-Meierplotter软件进行生存分析预测,从中挑选获得具有实验研究价值及潜在临床意义的候选癌基因FAM136A。二、候选癌基因FAM136A的临床表达研究与患者预后的相关性分析扩大样本量,选取177例肺癌组织（宣威组72例,非宣威组105例）,并以相应的癌旁形态学正常肺组织为对照,利用免疫组化SP法检测177对肺癌及对照组织中FAM136A的表达强度与分布面积。统计分析其表达情况与患者临床病理特征之间的相关性,并进行生存预后相关性分析。三、体外细胞生物学功能实验1.首先选取 6 株肺癌细胞 A549、H1975、H2342、H522、XLA-07、PC-9,病毒转化人支气管上皮细胞系BEAS-2B、转化人支气管上皮样细胞16HBE,用Western blot方法检测各株细胞内FAM136A蛋白的基础表达水平,从中挑选出A549和PC-9两株肺腺癌细胞进行后续体外、内细胞学实验研究。2.靶向合成特异性敲减小干扰RNA即siRNA-FAM136A,进一步合成并包装敲减慢病毒LV-SiRNA-FAM136A,并以无关敲减序列（scramble）为对照,瞬时感染细胞株A549和PC-9后,进行后续功能实验:2.1采用CCK8实验法检测敲减FAM136A后对细胞增殖活力的影响;2.2采用Wound Healing实验检测敲减FAM136A对细胞迁移功能的影响;2.3采用流式细胞技术检测敲减FAM136A后对细胞周期分布变化及细胞凋亡的影响;2.4采用ATP试剂盒检测减FAM136A后对细胞ATP代谢水平的影响;2.5采用LDH试剂盒检测敲减FAM136A后对细胞LDH代谢水平的影响;2.6采用透射电镜观察敲减FAM136A后对细胞自噬的形态学影响;2.7采用Western blot检测敲减FAM136A后对细胞增殖信号通路关键节点蛋白的影响;对细胞周期关键蛋白的影响;对细胞自噬相关核心蛋白表达变化水平。四、动物学水平体内实验用慢病毒LV-shFAM136A感染细胞株A549后,扩增细胞。在裸鼠适当周龄时,于裸鼠腋下皮下注射感染细胞,构建肺癌移植瘤模型;每天测量裸鼠移植瘤长、短径;称量裸鼠体重,观察裸鼠生长状态。饲养适当时间后,断颈脱臼处死裸鼠,解剖瘤体,测量长短经,称取瘤体净重量,统计分析。[结 果]一、我们首先通过15对（宣威地区代表性肺癌9例、非宣威地区肺癌6例）肺癌组织及其癌旁形态学正常肺组织mRNA表达谱芯片数据库筛选获得差异表达基因,其中宣威肺癌组表达上调基因1440个,表达下调基因2120个;非宣威肺癌组表达上调基因1182个,表达下调基因1661个。对所筛选宣威组差异表达基因芯片结果通过生物信息学分析,利用DAVID工具进行GO富集度、KEGG通路富集分析后,发现差异表达基因生物学功能主要涉及血管生成、细胞粘附、环一磷酸腺苷应答、细胞外基质、药物应答、血液凝固、细胞外间隙、细胞外基质蛋白、细胞表层、胞外区域、细胞质膜、胞质膜外侧面、细胞外基质、细胞间连接、钙通道结合、肝素结合、磷酸化蛋白、相关基因主要与补体与凝血系统等调控通路有关。用STRING数据库进行蛋白网络互作分析,进一步利用Cytoscape软件筛选出核心基因（Hub）基因。获得蛋白互作网络结构关系连接度前十位的核心基因为:FAM136A、LPAR3、ACTN2、GNAI1、PBP、JUN、ANXA1、EGF、PIK3R1、AGTR1。最后利用Kaplan-Meier plotter在线软件进行生存分析预测,预测结果显示,FAM136A与患者总生存期、无疾病进展期均密切相关。这为后续研究提供了新的切入点。二、进一步扩大筛选样本量,收集获得177例（宣威组75例,非宣威组102例）包含患者完整随访信息的肺癌样本组织,利用免疫组化SP法检测FAM136A的表达强度与分布。统计分析其表达情况患者临床病理特征之间的相关性,结果显示:FAM136A在宣威与非宣威癌组织间表达并无统计学差异;而宣威组、非宣威组内癌组织与正常组织间表达均有统计学差异性;综合统计发现有79例（44.6%）样本组织可检测到FAM136A呈阳性表达,并且FAM136A阳性表达与TNM分期、淋巴结转移具有相关性;其中更为重要的是,我们发现在淋巴结转移肺癌患者中,FAM136A 阳性表达患者总生存期缩短且具独立相关性,可作为这部分患者预后不良的的独立预后因素。三、体外实验结果A549和PC-9细胞感染慢病毒LV-shFAM136A后,依次进行以下实验:1)CCK8实验检测发现A549和PC-9细胞增殖活力受抑制,2)Wound healing实验检测发现细胞迁移能力降低,3)流式细胞技术检测发现细胞凋亡增加,其中A549细胞较为显著,细胞周期分布变化主要为G1期细胞增加,S期细胞减少,4)ATP检测试剂盒检测发现细胞ATP合成水平增加,5)LDH检测试剂盒检测发现细胞LDH代谢水平减少,6)透射电镜观察提示对细胞自噬的形态学影响并不显著,7)Western blot检测发现细胞增殖信号通路关键节点蛋白c-jun表达水平降低细胞周期关键蛋白CDK4/CDK6表达水平降低。五、体内动物学实验随时间延长,实验组、对照组裸鼠移植瘤体积均呈逐渐增大趋势,但慢病毒LV-shFAM136A感染细胞株移植瘤瘤体明显增殖速度明显慢于无关序列慢病毒感染组移植瘤。在裸鼠适当周龄时,断颈处死裸鼠,解剖瘤体,测量长短经,统计分析显示实验组移植瘤体积明显小于对照组。观察裸鼠生长状态没有异常变化,裸鼠体重变化差异没有统计学显著性。[结 论]一、宣威肺癌组织mRNA表达谱的差异基因功能主要集中于血管生成、细胞粘附、环一磷酸腺苷应答、细胞外基质、药物应答等方面;主要参与细胞增殖、细胞周期调控、补体与凝血系统等调控通路。二、FAM136A的表达与淋巴结转移患者的总生存期预后独立相关,可作为判断该部分患者生存期的一个独立预后因子。三、FAM136A可促进肺癌细胞株A549和PC-9的增殖、提高细胞的迁移能力。影响A549和PC-9的细胞周期分布,并在抑制细胞凋亡的生物学效应中发挥作用;FAM136A参与了 A549和PC-9细胞的ATP代谢、LDH代谢。四、FAM136A可以通过提高细胞周期蛋白CDK4/CDK6表达水平,调控细胞周期分布;Myc-FAM136A-CDK4/CDK6调控轴可能是一个潜在增殖信号通路。五、FAM136A可以在裸鼠体内促进肺癌细胞增殖。