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第一部分 梭菌属代谢物对甲酚硫酸盐/对甲酚葡糖醛酸在原发性胆汁性胆管炎患者中的表达及其影响因素[目 的]研究梭菌属代谢物对甲酚硫酸盐（PCS）/对甲酚葡糖醛酸（PCG）在原发性胆汁性胆管炎（PBC）患者中的表达水平及其影响因素。[方 法]选取明确诊断的PBC患者34例和经过年龄、性别匹配的健康对照组30例,应用代谢组学分别检测两组血清中PCS/PCG、芳香族氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸）的表达水平。分析PCS在不同病期和不同肝功能Child分级的差异。分析PCS与碱性磷酸酶、谷氨酰基转移酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶的相关性。[结 果]（1）PCS和PCG在PBC患者和健康对照组血清中浓度差异:PBC患者血清中PCS的浓度水平明显低于健康对照组,差异有统计学意义;PCG的表达水平在PBC组和健康对照组无统计学差异。（2）芳香族氨基酸在PBC患者和健康对照组中血清峰阈值差异:PBC患者血清中酪氨酸、苯丙氨酸的峰阈值明显高于健康对照组,差异有统计学意义,色氨酸水平两组无统计学差异。（3）PCS在不同病期的浓度差异:2期患者低于PBC 3期和4期的患者,差异有统计学意义,3期和4期的浓度水平无统计学差异。（4）PCS在肝功能分级的差异:PCS在Child-A级、Child-B级和Child-C级患者的平均浓度之间无统计学差异。（5）PCS与肝功能指标的相关性分析:PCS与碱性磷酸酶、谷氨酰基转移酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶进行相关性分析,相关系数R值均小于0.4。[结 论]1.PBC患者血清中PCS水平下降,酪氨酸水平和苯丙氨酸水平升高,PCG水平和色氨酸水平无显著区别;2.PBC患者和健康对照组的血清分布以PCS为主,而不是以PCG为主;3.不同病期PBC患者血清中PCS浓度不同;4.不同肝功能分级的PBC患者血清中PCS浓度无差异;5.PBC患者血清中PCS浓度水平与碱性磷酸酶、谷氨酰基转移酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平不相关。第二部分梭菌属代谢物对甲酚硫酸盐在原发性胆汁性胆管炎小鼠中的表达及其作用研究[目 的]研究梭菌属代谢物对甲酚硫酸盐（PCS）在原发性胆汁性胆管炎（PBC）模型小鼠中的作用[方 法]C57BL/6雌性小鼠分为3组:正常对照组、PBC组、PBC酪氨酸组。采用化学诱导造模的方法制作PBC小鼠模型,根据预实验的结果,PBC酪氨酸组在PBC成模后喂食富含酪氨酸饲料10天,PBC组继续普通饲料喂养10天,正常对照组普通饲料喂养不作任何处理,小鼠处理后,比较三组小鼠肝脏炎症反应。UPLC-ESI-QTOF-MS检测三组小鼠血清、肝脏中的PCS的浓度,用CD86标记肝脏的M1 Kupffer细胞和CD206标记M2 Kupffer细胞,分别比较PBC小鼠和特殊饲料组小鼠与正常小鼠的肝脏Kupffer细胞极化情况。ELASA分析各组小鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α和TGF-β的表达水平。PCR和WB分析各组小鼠肝脏中IL-6、IL-10、TNF-α和TGF-β的表达水平。[结 果]（1）成功建立PBC小鼠模型经验证符合PBC诊断标准;（2）PCS在PBC小鼠中的浓度:PBC小鼠肝脏、血清中PCS的浓度低于正常对照组小鼠,PBC酪氨酸组小鼠肝脏、血清中PCS的浓度和正常对照组小鼠无差异;（3）PCS对PBC小鼠肝脏炎症的影响:免疫组化结果显示,PBC小鼠炎症反应明显,PBC酪氨酸小鼠肝脏炎症减轻;（4）Kupffer细胞变化:在PBC小鼠中,以M1 Kupffer细胞CD86极化为主;PBC酪氨酸组,以M2 Kupffer细胞CD206极化为主;（5）PCS对PBC小鼠细胞因子分布的影响:ELASA、PCR和WB结果均显示,PBC组小鼠的IL-6、TNF-α和TGF-β的水平均高于正常对照组小鼠,IL-10的水平低于正常小鼠,喂食酪氨酸的PBC小鼠的IL-6、TNF-α和TGF-β的水平下降,IL-10水平上升。[结 论]1.PBC小鼠造模成功;2.PBC小鼠补充酪氨酸食物后会升高血浆、肝脏中的PCS水平;3.酪氨酸来源的PCS可以部分缓解PBC小鼠肝脏炎症;4.酪氨酸来源的PCS可以逆转PBC小鼠肝脏Kupffer细胞极化方向;5.酪氨酸来源的PCS可以降低PBC小鼠肝脏致炎因子水平,升高抗炎因子水平。第三部分梭菌属代谢物对甲酚硫酸盐对胆管上皮细胞和Kupffer细胞的作用及机制研究[目 的]研究梭菌属代谢物对甲酚硫酸盐对胆管上皮细胞和Kupffer细胞的作用[方 法]选取不同浓度的对甲酚硫酸盐（PCS）刺激SD大鼠胆管上皮细胞,观察细胞形态,CCK-8检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期,EdU检测加药后胆管上皮细胞的增殖,qRT-PCR检测200μg/ml的PCS加入胆管上皮细胞后NLRP3、IL-1、IFN-γ、TNF-α、BCL-2、Caspase-1、Caspase-9、GSDMD、NOX2、P22、TGF-β1和TIMP-1的表达,不同浓度PCS加入胆管上皮产生活性氧的荧光强度,WB检测不同浓度的PCS与胆管上皮细胞培养后NOX2和P22的表达,WB检测慢病毒转染NOX2和P22后的表达水平。PCS与SD大鼠Kupffer细胞共培养,流式检测极化方向,qRT-PCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL3、IL-10、Arg-1 的表达,WB 检测 IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL3、IL-10、Arg-1 的表达。采用LPS损伤胆管上皮细胞后,再与PCS作用的Kupffer细胞共培养,qRT-PCR检测 TNF-α、IL-8、MCP-1、IL-1β、CX3CL1、IL-10 的表达水平,WB 检测 TNF-α、IL-8、MCP-1、IL-1β、CX3CL1、IL-10的表达水平,共培养结束后,分别取各组的上清,ELASA 检测 TNF-α、IL-8、MCP-1、IL-1β、IL-10 的表达水平。[结 果]（1）PCS对正常胆管上皮细胞的作用:①不同浓度的PCS对胆管上皮细胞形态有影响,浓度越高,细胞形态变化越明显;②CCK8的结果显示,PCS对胆管上皮细胞活力的抑制呈现剂量依赖性;③qRT-PCR结果显示,PCS加入胆管上皮细胞后 NLRP3、IL-1、IFN-γ、TNF-α、BCL-2、Caspase-1、Caspase-9、GSDMD的水平变化不明显,NOX2、P22、TGF-β1和TIMP-1水平均升高;④浓度为200μg/ml的PCS加入胆管上皮产生ROS的荧光强度最强;⑤浓度为200μg/ml的PCS加入胆管上皮NOX2和P22的蛋白表达水平最高,慢病毒转染后NOX2和P22的表达水平下降;（2）PCS对正常Kupffer细胞的作用:①流式结果显示PCS可以逆转Kupffer细胞的极化方向;②qRT-PCR结果显示,Kupffer细胞的IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL3的表达水平下降,IL-10、Arg-1的表达水平升高;③WB结果显示,Kupffer细胞的IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL3的蛋白水平下降,IL-10、Arg-1的蛋白水平升高;（3）PCS通过Kupffer细胞对LPS损伤胆管上皮细胞的作用:①qRT-PCR和WB结果均显示,PCS可以通过活化Kupffer细胞降低LPS损伤的胆管细胞的TNF-α、IL-8、MCP-1、IL-1β、CX3CL1的表达水平,升高IL-10的表达水平;②ELASA检测共培养后的上清,结果显示PCS可以通过活化Kupffer细胞降低LPS损伤的胆管细胞上清的TNF-α、IL-8、MCP-1、IL-1β的表达水平,升高IL-10的表达水平。[结 论]1.PCS可以损伤正常的胆管上皮细胞发生氧化应激和表达致纤维化因子;2.PCS可以逆转Kupffer细胞的极化方向向M2转变;3.PCS通过逆转Kupffer细胞的极化方向保护受损伤的胆管上皮细胞,减轻PBC的炎症损伤。