研究背景及目的:心脑血管疾病是目前全球范围内致死率和致残率都非常高的疾病,其本质上的病理变化是相关血管的动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)。研究认为AS是一种免疫性疾病,感染、免疫缺陷及自身免疫都参与了 AS的病理、生理过程。固有免疫和适应性免疫的多种免疫细胞和免疫因子参与了 AS的发生和发展,自然杀伤细胞(NK细胞)和自然杀伤T细胞(NKT细胞)被发现存在于AS斑块中,参与了 AS的形成。研究表明,AS中NK细胞数量下降,细胞毒性功能减弱。NK细胞可分为功能不同的两个亚群:CD3-CD56bright NK细胞和CD3-CD56dim NK细胞。NKT细胞是兼有NK细胞和T细胞特征的一群细胞,表面同时表达NK细胞和T细胞上存在的部分分子结构。NK细胞和NKT细胞活化后均可分泌干扰素-γ(IFN-γ),动物实验显示IFN-y有促进AS形成的作用。T细胞免疫球蛋白黏蛋白 3(T cell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3,Tim-3)是一型跨膜蛋白Tim家族的一员,被发现表达于T细胞、NK细胞、NKT细胞等多种细胞表面。在慢性乙型肝炎患者中,NKT细胞上Tim-3表达上调;在多种疾病状态下,NK细胞上Tim-3表达均升高,同时伴有NK细胞的细胞毒性及IFN-γ分泌减少。在动脉粥样硬化患者外周血中,NK细胞上Tim-3分子也被发现表达升高。他汀类药物是一种3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,临床上广泛用于AS的治疗,对AS及相关疾病有良好的治疗效果。研究提示,他汀类药物发挥抗AS的作用并不完全依赖于其降血脂的功效,他汀类药物的免疫调节作用在其中有着重要影响。他汀类药物通过抑制HMG-CoA还原酶而影响下游多种成分的生成,进而影响下游小分子参与的生物过程,发挥免疫调节作用。然而,他汀类药物通过免疫调节作用治疗AS的机制尚不完全清楚,本研究旨在通过研究他汀类药物对AS外周血NK细胞和NKT细胞表面Tim-3分子和IFN-y分子的影响,初步探索他汀类药物治疗AS可能通过的免疫途径,为临床治疗提供更多的实验和理论基础。研究对象和方法:1.研究对象:研究对象为2016年1月-12月期间于山东省千佛山医院就诊的35岁-79岁的患者,经影像学或者超声检查诊断患有AS。严格按照入选标准和排除标准筛选患者。本研究由山东大学千佛山医院伦理委员会批准。每一位入组的患者均被告知了本研究,并同意了相关事宜。有14例服用瑞舒伐他汀治疗的患者(其中2位患者每天10 mg,其余患者每天20 mg,口服,连续服用3个月以上)和12例服用阿托伐他汀治疗的患者(其中1位患者每天5 mg,其余患者每天10 mg,口服,连续服用3个月以上)被纳入实验,以及20例未服用他汀类药物治疗的患者被纳入实验作为对照。抽取每位被纳入实验的患者的空腹外周静脉血。2.实验方法:将收集的外周血尽快使用淋巴细胞分离液处理,提取外周单个核细胞(PBMCs),制备细胞悬液。取PBMCs细胞悬液,加入FITC标记的抗人CD3、PerCP标记的抗人CD56及APC标记的抗人Tim-3的抗体,于4℃避光环境下孵育30分钟后上机检测NK细胞(CD3-CD56+细胞),CD3-CD56bright NK细胞,CD3-CD56dim NK 细胞,CD3-CD56+Tim-3+ 细胞,CD3-CD56brightTim-3+ 细胞,CD3-CD56dimTim-3+ 细胞,NKT 细胞(CD3+CD56+ 细胞),CD3+CD56+Tim-3+ 细胞,CD3+Tim-3+细胞以及Tim-3分子在NK细胞及其亚群上的平均荧光素强度(mean fluorescence intensity,MFI)。另取PBMCs细胞悬液在含刺激阻断剂的完全培养基中培养2小时之后,加入FITC标记的抗人CD3、PerCP标记的抗人CD56抗体于4℃避光环境下孵育30分钟后,固定、破膜,加入PE标记的抗人IFN-γ抗体,于4℃避光环境下孵育30分钟后重悬上机,流式检测CD3-CD56+IFN-γ 细胞、CD3+CD56+IFN-γ+ 细胞和 CD3+IFN-γ+ 细胞。3.统计学处理:采用SPSS 20统计软件分析数据,计量资料中,符合正态分布及方差齐的数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA),其余数据采用非参数检验(Kruskal-Wallis one-wayANOVA)比较三组样本的组间差异。分类变量资料采用χ2检验(chi-square test)进行分析。p<0.05为差异有统计学意义。结果:1.共有46例患者被纳入研究,在瑞舒伐他汀治疗组、阿托伐他汀治疗组和对照组中,男性患者所占比例无明显差异(78%,67%,75%,p=0.78),年龄无统计学差异(63.3±2.4,67.1 ±2.3,64.0±1.9,p=0.48),糖尿病患者所占比例无统计学差异(21%,33%,20%,p=0.67)。2.他汀类药物治疗降低了 NK细胞及其细胞亚群中Tim-3+细胞所占的比例以及三群细胞上Tim-3的MFI(瑞舒伐他汀治疗组vs对照组和阿托伐他汀治疗组vs对照组的p值依次为:Tim-3+ NK细胞p=0.003,p=0.003;NK细胞上Tim-3的MFI p=0.019,p=0.011;CD3-CD56brightTim-3+ NK 细胞p=0.002,p=0.001;CD3-CD56bright NK细胞中 Tim-3 的 MFI,p=0.004,p=0.004;CD3-CD56dimTim-3+ NK细胞p=0.004,p=0.005;CD3-CD56dimNK细胞中Tim-3 的 MFI,p=0.021,p=0.013)。3.他汀类药物治疗降低了 NKT细胞和CD3+T细胞中Tim-3+细胞的比例(瑞舒伐他汀治疗组vs对照组:p<0.001,p<0.001;阿托伐他汀治疗组vs对照组:p<0.001,p=0.009);增加了外周血单个核细胞中NKT细胞的比例(瑞舒伐他汀治疗组vs对照组:p=0.092;阿托伐他汀治疗组vs对照组:p=0.017)。4.各个细胞群中,干扰素-γ的产生无明显差异。结论:他汀类药物可降低AS中NK细胞及其细胞亚群表面、NKT细胞表面和CD3+T细胞表面Tim-3分子表达,增加外周血中NKT细胞的比例,但不影响IFN-γ的产生,这可能在他汀类药物的抗动脉粥样硬化治疗中发挥了一定作用,可能是他汀类药物治疗AS通过的免疫机制,但是具体的作用机制有待于进一步深入研究。