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目的:急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的病理生理基础是强烈的炎症反应:中性粒细胞浸润和补体激活。中性粒细胞激活后释放出中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular trap,NETs),进一步加重肾损伤。我们前期结果证明补体C3在缺血再灌注中起重要作用,但是C3和中性粒细胞在AKI中的关系尚不明确。本研究旨在观察C3、中性粒细胞在AKI中的作用,并进一步探索补体C3对中性粒细胞浸润和NETs形成的影响。方法:制备缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion,IRI)模型:将野生型鼠(Wild type,WT)随机分为对照组、假手术组、缺血再灌注6h组、12h组、24h组、48h组,每组6只,采用双侧肾脏同时夹闭肾动脉45 min后恢复血流灌注6h、12h、24h、48h的方法建立肾脏缺血再灌注急性肾损伤模型;制备中性粒细胞清除鼠缺血再灌注损伤模型:WT鼠在制备缺血再灌注损伤模型前24 h、前2 h腹腔注射抗Ly6G单克隆抗体1A8以清除小鼠体内的中性粒细胞(IRI 24h+1A8组),对照组注射同型对照抗体IgG(IRI 24h+IgG组),夹闭小鼠双侧肾蒂夹闭45 min后恢复血流灌注24 h;制备C3基因敲除鼠(C3KO IRI 24h组)缺血再灌注模型:同时夹闭C3 KO鼠双侧肾蒂夹闭45 min后恢复血流灌注24 h。收集血液及肾脏标本,测定血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)水平;HE染色观察肾小管、肾间质损伤程度;血常规、瑞氏-吉姆萨染色测外周血中性粒细胞水平,Ly6G、MPO、ICAM-1免疫组化及Western blot测肾脏中性粒细胞浸润情况;免疫荧光对C3进行定位及半定量,实时荧光定量PCR及ELISA对肾组织的C3进行定量;DAPI、Ly6G、CitH3免疫荧光双染观察NETs的形态,Western Blot对CitH3进行定量。从健康人外周血分离出中性粒细胞,用瑞氏-吉姆萨染色测细胞纯度。以PMA为阳性对照,RPMI为阴性对照,分别用0.01μM、0.1μM和1μM C3a干预中性粒细胞4 h。用DAPI、MPO、CitH3免疫荧光双染色观察NETs的形态,Western Blot对CitH3进行定量。结果:在体内:1.小鼠缺血再灌注损伤后肾功能逐渐恶化,中性粒细胞和NETs浸润逐渐增多,主要浸润至皮髓交界,且表达高峰在24 h;补体C3主要表达在肾间质,随再灌注时间的延长而进行性增多。提示中性粒细胞及C3均参与了缺血再灌注损伤的进程。2.与同型对照抗体组相比,中性粒细胞清除组的肾功能明显改善,NETs的形成明显减少;而补体C3的表达在中性粒细胞清除与未清除组间未见明显差异。提示缺血再灌注损伤时,中性粒细胞的浸润可以加重肾组织损伤,通过有效的清除小鼠体内的中性粒细胞可以减少NETs的形成,进而减轻肾损伤,但中性粒细胞的浸润对C3的产生无直接影响。3.与WT鼠IRI组相比,C3 KO鼠IRI组肾功能明显改善,中性粒细胞表达明显减少,NETs形成也明显减少。提示缺血再灌注损伤时,C3可以介导中性粒细胞浸润至肾脏,而靶向敲除C3可以减少中性粒细胞的浸润、降低NETs的形成,进而减轻肾损伤。在体外,健康人外周血分离的中性粒细胞纯度大于95%。用阳性对照PMA干预中性粒细胞,其释放明显的网状结构,且染色质解聚,而0.1μM C3a干预也刺激中性粒细胞释放网状结构NETs,但中性粒细胞胞核完整,可见明显的分页核。结论:补体C3、中性粒细胞、NETs共同参与了缺血再灌注肾损伤,C3基因敲除可以减少中性粒细胞的浸润和NETs的形成,减轻缺血再灌注肾损伤;外源性C3a可以诱导中性粒细胞产生NETs。