哺乳动物体细胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transfer，SCNT)和诱导多能性干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs)都证明终末分化的成体细胞可以被重编程为胚胎样多能细胞。但目前SCNT和iPSCs都存在效率低的问题，尤其对于分化状态较高的起始细胞很难重编程为多能性细胞。近来研究表明，在细胞重编程过程中增加转录因子或者表观修饰相关基因的表达可以提高重编程效率。　　组蛋白甲基化转移酶(Histone Methyltransferase，HMT)包含一大类表观遗传修饰酶，在早期胚胎发育、干细胞多能性维持和分化、细胞重编程等过程具有广泛调控作用。其中SMYD3(SET and MYND domain-containing protein3)是组蛋白H3赖氨酸4二甲基化(H3 K4me2)和三甲基化(H3 K4me3)转移酶;最早在癌细胞中发现，SMYD3能与RNA聚合酶Ⅱ形成转录复合物，激活下游一些癌基因和细胞周期相关基因的表达，在癌细胞增殖、迁移和侵袭中起作用。但目前关于SMYD3在哺乳动物早期胚胎发育及细胞重编程中作用的研究还鲜有报道。　　本研究首先检测了SMYD3在牛卵母细胞成熟和植入前胚胎发育过程中的表达，并通过RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术下调SMYD3的表达研究其在胚胎发育过程中的作用;其次通过在体细胞中过表达SMYD3，研究其对细胞增殖和重编程相关基因表达的影响和调控机制，并利用诱导干细胞技术研究细胞过表达SMYD3对重编程效率的影响。主要研究内容如下:　　1.SMYD3对牛卵母细胞成熟和胚胎发育的影响　　首先利用定量PCR方法检测了SMYD3在牛卵母细胞成熟和植入前胚胎发育过程中的表达。结果显示，SMYD3 mRNA在牛卵母细胞成熟到植入前胚胎发育的8细胞期的表达虽有上下波动，但变化不显著基本维持一个水平(p＞0.05)，到桑椹胚期表达显著升高，并达到峰值(p＜0.01)，之后到囊胚期表达又下降到之前水平。免疫荧光染色结果显示，在MⅡ期SMYD3染色主要集中于染色体上，受精后SMYD3在胚胎胞质和核内都有表达，特别在桑椹胚和囊胚中，SMYD3在胞质中的染色明显强于核内。通过GV期显微注射SMYD3 siRNA的方法下调卵母细胞成熟过程中的SMYD3 mRNA水平，可以显著降低MⅡ期卵母细胞中NANOG mRNA水平(p＜0.01)，最终导致受精后胚胎发育阻滞在8细胞时期;而在原核期注射SMYD3 siRNA对胚胎发育没有影响。本实验结果表明卵母细胞中存储的SMYD3可调节NANOG基因在卵母细胞中的表达，并对牛早期胚胎发育起重要作用。原核期注射SMYD3 siRNA对胚胎发育没有影响也间接证明SMYD3对胚胎发育的影响是在卵母细胞成熟过程中积累起来的。　　2.SMYD3对牛胎儿成纤维细胞生长的影响　　转录因子影响细胞重编程效率通常依赖于两种机制，即细胞周期依赖性机制和细胞周期非依赖性机制。前者主要通过影响细胞增殖实现，而后者主要是通过表观遗传修饰改变基因表达模式从而增强重编程。本研究将从这两方面研究SMYD3对牛胎儿成纤维细胞（bovine embryonic fibroblast，bEF）重编程的影响。　　本研究首先设计了过表达SMYD3的质粒pSMYD3-IRES2-Zsgreen1和下调MYD3的质粒pRFP-CB-shLenti-SMYD3，并通过脂质体转染或慢病毒感染的方法转入bEF中，研究SMYD3对bEF增殖及基因表达的调节作用。其次利用诱导干细胞技术研究了过表达SMYD3对成纤维细胞重编程效率的影响。结果显示，SMYD3在bEF中过表达后，能够促进bEF的增殖;基因表达检测显示，SMYD3的过表达会显著促进表观修饰相关基因DNMT1、DNMT3a和EZH2，及与全能性和谱系决定相关基因NANOG、c-MYC、GATA6、PAX6、NESTIN的表达，而对细胞周期调控相关基因CCNG1和CDK2的表达影响不显著，但显著提高MAP3K11的表达(p＜0.001);相反，下调SMYD3基因的表达后，以上所检测的基因表达均有显著的下降(p＜0.001)。说明SMYD3对这些基因的表达有调控作用。由于SMYD3在胚胎发育过程和bEF中都对NANOG基因的表达有调节作用，为了确定SMYD3与NANOG相互作用关系，分别利用亚硫酸氢盐测序技术(Bisulphite PCR，Bis-PCR)和免疫共沉淀技术（ChIP-PCR）分析了NANOG基因启动子区DNA甲基化程度和与SMYD3的结合情况。DNA甲基化分析发现，SMYD3过表达后NANOG启动子区DNA甲基化增加，ChIP-PCR实验显示SMYD3没有在NANOG启动子区结合，说明SMYD3是通过间接作用的方式协同DNA甲基化和组蛋白修饰影响NANOG基因的表达。　　由于SMYD3的过表达能够促进bEF细胞的增殖，同时能够影响多能性相关基因、谱系决定基因和表观遗传修饰相关基因的表达，推测SMYD3可能会促进细胞重编程。为此，本研究利用慢病毒介导的方法用鼠源的Oct4、c-Myc、Sox2和Klf4四因子导入过表达SMYD3基因的bEF细胞中，研究SMYD3对细胞重编程效率的影响。结果显示与非转基因细胞相比，过表达SMYD3基因的bEF中有克隆形成，而对照组的非转基因细胞中却没有克隆形成;这些克隆经多能因子OCT4、NANOG和SOX2免疫荧光染色后均显示阳性，这些结果初步说明SMYD3可以促进细胞克隆形成，对细胞重编程有促进作用。　　以上研究表明，组蛋白甲基化转移酶SMYD3通过影响多能性相关基因和表观遗传修饰相关基因的表达，在牛卵母细胞成熟、植入前胚胎发育和牛胎儿成纤维细胞生长过程中起作用，同时影响细胞的重编程。