论文部分内容阅读
植物蛋白酶抑制剂是一类具有蛋白酶抑制活性的蛋白质或多肽，在植物界尤其是茄科和豆科植物中广泛存在。本研究以茄科植物龙葵(Solanum americanum)为材料，经过一系列的分离纯化操作，得到了对丝氨酸类蛋白酶有抑制活性的蛋白质，Tricine-SDS-PAGE上显示其为两条多肽，表观分子量分别约为5 kDa和7kDa。将这两种蛋白酶抑制剂分别命名为G1(5 kDa)和G2(7 kDa)。利用串联质谱(MS-MS)分析了两条多肽的序列，结果各得到其上一段氨基酸残基序列，分别为GlP：IAYGICPLS；G2P：IAYGICPRSEEK。经过BLAST比对发现这两段氨基酸序列与烟草中的一类PIN2家族的蛋白酶抑制剂同源性很高，烟草中的此类PIN2家族蛋白酶抑制剂具有多个重复序列，经翻译后修饰作用可被剪切为多个低分子量的且具有抑制活性的蛋白酶抑制剂。分析G1P和G2P的氨基酸序列，发现两者同源性很高，所以据此推测G1和G2也可能是来自同一个蛋白质前体，是经过翻译后的修饰作用，被剪切成的两个低分子量的蛋白酶抑制剂。
零研究依据测序得到的氨基酸序列设计PCR引物，克隆到一个植物蛋白酶抑制剂的cDNA序列，将其命名为SaPIN2c，同时得到其基因组序列，分析发现基因组序列不含有内含子。利用克隆得到的SaPIN2c cDNA序列，本研究构建了其大肠杆菌(Ecoli)表达载体pZJG09及植物表达载体pZJG11，以用于下一步的原核表达分析和转基因植物研究。本研究还将已得到cDNA序列全长的另外一种龙葵蛋白酶抑制剂基因SaPIN2b克隆进pGEX-4T-1表达载体，在大肠杆菌(E.coli)中进行了重组表达，得到了融合蛋白GST-SaPIN2b。GST-SaPIN2b融合蛋白部分可溶，对其进行了亲和层析纯化，然后用凝血酶切去GST部分，并利用胰蛋白酶柱亲和层析纯化得到重组的SaPIN2b(rSaPIN2b)。利用rSaPIN2b进行了蛋白酶抑制实验，结果发现rSaPIN2b对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶具有明显的抑制作用，而且对两种害虫(斜纹夜蛾和棉铃虫)中肠蛋白酶也表现出抑制效果，这为利用SaPIN2b基因获得转基因抗虫植物提供了理论依据。