稻田生物固氮是稻田比旱地具有更高土壤氮素肥力的重要原因。然而，由于研究生物固氮技术手段的限制，稻田生物固氮研究进展缓慢。稻田生物固氮作用由固氮微生物驱动，固氮微生物群落结构及其活性的变化势必影响稻田生物固氮作用。因此，开展生物固氮装置研发和稻田固氮微生物研究对全面评价稻田生物固氮作用及合理制定调控措施具有重要意义。本研究自主研发了15N2稳定性同位素气体田间原位标记装置，研究了光合固氮、异养固氮对砂姜黑土稻田生物固氮的贡献和生物固定氮素的再分配;研究了砂姜黑土稻田光合和异养固氮微生物群落结构;结合15N2气体标记技术和稳定性同位素核酸探针技术DNA-SIP(Stableisotope probing)研究了稻田生物固氮的主要贡献者等。　　15N2气体标记法是一种最直接测定生物固氮的方法，可以排除其他来源氮的干扰。本研究中，我们自主研发了适用于15N2气体田间原位标记的植物生长箱（发明专利号:ZL200910232184.3），实现了生长箱内温度、CO2浓度、湿度的自动监测与控制。在15N2气体田间原位标记试验中，该植物生长箱系统在高温高湿稻田连续运行70天，15N2标记箱和对照箱内白天CO2浓度平均值均在360-380 ppm，生长箱内温度随着环境温度的变化而变化(±2℃)，白天生长箱内相对湿度的平均值为60％。结果表明，该生长箱系统在稻田原位环境下能够很好地控制箱内植物生长环境因子，满足15N2气体田间原位标记要求，解决了长期制约稻田生物固氮研究的关键技术，为拓展稻田生物固氮研究奠定了基础。　　70天15N2气体田间原位标记结果显示，15N2标记箱内，不种水稻土壤表面蓝藻的15N原子百分超最高，为2.549±0.738 atom％。表层土壤(0-1cm)的15N丰度要显著高于其他层次(2-15cm)土壤样品(P＜0.05)。生物固定的15N约49％被植物吸收利用，51％残留于土壤中。与空白土壤处理相比，种水稻处理下异养固氮量提高了4.8倍，光合固氮量提高了2.4倍。本研究为稻田能够进行生物固氮提供了直接证据。　　应用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)和nifH基因克隆文库研究了水稻生长和土壤表面遮光处理对稻田土壤固氮微生物群落结构的影响。nifH克隆测序结果显示，稻田土壤固氮菌主要属于变形杆菌门（Proteobacteria），分布在Alpha-和Delta-类变形杆菌（Proteobacteria）亚门，如固氮螺菌属（Azospirillum）、固氮弧菌属（Azoarcus）、土杆菌属（Geobacter）等。近80％的固氮菌具有钼-铁固氮酶ClusterⅠ类特性;20％的固氮菌具有严格厌氧特性，属于固氮酶ClusterⅢ类。实时荧光定量PCR结果显示，种水稻处理下表层土壤nifH基因的拷贝数高于空白土壤处理，而土壤表面遮光处理下表层土壤nifH基因的拷贝数低于不遮光处理，不同处理间nifH拷贝数无显著性差异。T-RFLP和nifH克隆测序结果表明，种水稻处理和空白对照处理表层土壤中固氮微生物群落结构无明显差异，土壤表面遮光处理抑制了蓝细菌(cyanobacteria)的生长。　　为进一步揭示稻田土壤固氮微生物的固氮活性，我们将田间原位15N2标记技术与稳定同位素核酸探针(DNA-SIP)技术相结合。15N2标记结束后，提取种水稻和空白土壤处理下表层土壤DNA，通过超高速氯化铯密度梯度离心将15N-DNA与14N-DNA分离，利用T-RFLP、定量PCR和nifH基因克隆文库判定不同浮力密度DNA中15N-DNA的富集程度，分析不同浮力密度固氮菌的丰度与群落结构。研究结果显示，种水稻土壤中蓝细菌（Filamentous thermophiliccyanobaeteria）和固氮弧菌属（Azoarcus）在稻田生物固氮作用中起主导作用;对照土壤下δ-变形菌门菌（Proteobacteria）为优势固氮微生物类群，如脱硫弧菌属（Desulfovibrio）。15N2-DNA-SIP研究结果表明，与对照土壤相比，种水稻土壤中蓝细菌和固氮弧菌明显富集，可能是本研究中稻田生物固氮的主要贡献者。