HSAF是生防产酶溶杆菌中新发现的一种结构新颖、生物合成和作用方式独特、对环境安全广谱抗真菌和卵菌的次生代谢产物,具有开发为绿色杀真菌或卵菌剂的应用前景。然而,产酶溶杆菌合成并外泌HSAF产量较低(1.8 μg/mL),这是将HSAF开发为生物农药过程中所面临的一个主要技术瓶颈。同时产酶溶杆菌对植物细菌病害没有防治效果,限制了该菌在植物病害生物防治中应用范围。c-di-GMP是细菌体内发现的一种核酸类第二信使,参与调控细菌多种重要的生物学功能。该胞内小分子化学信号由含有GGDEF结构域的蛋白负责合成,而且降解由含有EAL或HD-GYP结构域的蛋白负责。产酶溶杆菌中体内含有26个负责c-di-GMP合成或降解的蛋白,其中20个含有GGDEF结构域蛋白。本课题组在前期工作中发现产酶溶杆菌胞内高浓度的c-di-GMP抑制HSAF的合成,但具体的机制未知。本研究以具有自主知识产权的产酶溶杆菌OH11为研究系统,首先在其野生型菌株和rpfG突变株(一个c-di-GMP降解酶编码基因的突变株)中外源表达c-di-GMP的合成酶Slr或降解酶YhjH的编码基因,进一步从遗传学层面确认了 c-di-GMP对HSAF合成的抑制作用。在此基础上,以野生型OH11为出发菌株,连续敲除了 20个GGDEF结构域蛋白的编码基因,构建了一个胞内低c-di-GMP含量的工程菌株△XX,发现该菌株合成HSAF的能力显著提升。遗传学研究表明,△XX中HSAF的产量提升与其胞内c-di-GMP的含量密切相关,即外源表达c-di-GMP的合成酶Slr编码基因会显著降低AXX高产HSAF的能力。同时发现依赖于Clp蛋白的HSAF合成关键基因pks/nrps的转录提升是△XX高产HSAF的重要机制之一。这些研究结果表明,我们通过在产酶溶杆菌中构建零GGDEF结构域蛋白的菌株会导致该菌株中c-di-GMP的含量下降,这种下降会进一步通过依赖Clp蛋白的方式来激活HSAF合成关键基因pks/nrps的表达,提升HSAF的产量,从而解除c-di-GMP对HSAF合成的抑制效应。基于上述产酶溶杆菌中c-di-GMP抑制HSAF合成的信号途径,我们试图利用其开展合成生物学研究,即利用HSAF合成关键基因pks/nrps的启动子在AXX中高效驱动群体感应淬灭酶AidH和MomL编码基因的转录表达,构建相应的工程菌株,赋予产酶溶杆菌防治植物细菌病害的新功能。研究结果表明,在AXX中不论是染色体无标记整合aidH还是通过载体过量表达momL都能显著降低AHL(高丝氨酸内酯)产生的植物病原细菌---大白菜软腐病菌(Pactobacterium carotovorum)在大白菜上的致病性,与AHL群体感应系统控制该菌致病性的研究结论一致,表明我们通过c-di-GMP信号途径构建的产酶溶杆菌工程菌株具有破坏植物病原细菌群体感应系统的功能,从而赋予了产酶溶杆菌防治植物细菌病害的新功能。最后,我们通过AHL降解实验进一步确认了该结论,我们发现在AXX中过表达momL能显著降解培养体系中外源添加的AHL。综上,本研究首先通过遗传学研究初步解析了产酶溶杆菌胞内c-di-GMP抑制HSAF的信号途径,构建了 一个零GGDEF结构域蛋白的菌株,解除了 c-di-GMP对HSAF合成的抑制效应,实现了 HSAF的高产。同时利用这些基础研究的新发现开展了产酶溶杆菌的合成生物学研究探索,即在产酶溶杆菌中利用我们发现的c-di-GMP信号网络成功驱动表达了群体感应淬灭酶的编码基因,构建了相应的工程菌株,实现了该工程菌株对群体感应信号分子AHL的有效降解,进而破坏了植物病原细菌的AHL群体感应系统,降低了植物病原细菌的致病性,实现了产酶溶杆菌对植物细菌病害的生物防治,拓宽了产酶溶杆菌生防对象的范畴。