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近年来,由于各种疾病、意外事故等因素导致的各种组织和器官损伤的患者呈现逐年上升趋势,临床上通常需要进行自体或异体移植治疗。由于存在自体移植物缺乏和异体移植物免疫排斥等问题,需要应用生命科学与工程学的原理和技术来制备一系列组织和器官替代物,以维护和促进人体各种损伤组织和器官的修复及功能恢复,这就是组织工程所研究的内容和方向。组织工程修复损伤组织和器官所需要的三个重要因素是:种子细胞、支架、生长因子。其中,生长因子在组织工程修复中起着促进和调节细胞黏附、增殖、分化和成熟的作用,且每个阶段都需要不同种类的生长因子来促进损伤部位的再生。传统的生长因子与支架的结合方式主要有三种:共混法、吸附法和共价结合法。共混法、吸附法是通过生长因子与支架材料的静电吸附而结合在一起的,结合力相对较弱,细胞因子极容易扩散到周围组织,生物利用度较低,容易对周围或其它组织产生副作用。共价结合法是生长因子通过化学反应将氨基酸残基的侧链基团和支架材料上的活性基团共价结合的一种方式,这种结合方式虽然牢固,但存在反应条件苛刻,产率较低,生长因子易失活等缺点。 为了克服生长因子与支架材料这三种传统结合方式的缺点和不足。近年来,利用基因工程方法将具有特异结合性的结构域克隆入生长因子的末端,重组表达具有与支架材料特异结合能力的生长因子的策略应运而生。这样获得的生长因子不但具有生物学活性而且还具有与支架材料特异结合的特性。基于以上的原理,设计制备了一系列的具有特异结合能力的人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),包括能够与胶原蛋白特异结合的C-bFGF和V-bFGF,和与几丁质结合的ChtBD-bFGF。C-bFGF的粘性末端来源于Collagenase(TKKTLRT),V-bFGF来源于vWF(WREPSFCALS)。体外实验表明C-bFGF、V-bFGF和bFGF一样具有生物学活性,C-bFGF、V-bFGF与胶原的结合能力要高于bFGF。同时,为获得与几丁质特异结合的bFGF,先利用生物信息学方法分析筛选出能够与几丁质结合的结构域(ChtBD),并采用计算机软件分析预测了ChtBD和几丁质之间可能存在的特异结合能力。利用基因工程重组技术将ChtBD克隆入bFGF的N端,在大肠杆菌中原核表达ChtBD-bFGF。体外实验结果表明,ChtBD-bFGF与几丁质膜的结合能力是bFGF的11.4倍,并且具有与bFGF相同的生物学活性,能够明显促进成纤维细胞增殖。生长在结合有ChtBD-bFGF几丁质膜(ChtBD-bFGF@chitin)上的细胞数量显著地高于bFGF几丁质膜组(bFGF@chitin)和几丁质膜组(chitin)。体内实验结果表明,相对于其它实验组,ChtBD-bFGF@chitin能够有效地促进体内植入位置周围组织的血管化,加快兔耳创伤部位表皮的重建速度。综上所述,利用基因工程重组技术制备了具有胶原结合能力的C-bFGF和V-bFGF,并且首次制备了具有几丁质结合能力的ChtBD-bFGF。携带ChtBD-bFGF的几丁质膜在动物实验中表现出优异的促血管生成和促进创伤修复的能力,因此是一种潜在的新型生物活性创伤修复敷料。 生长因子在组织工程修复中起着至关重要的作用,但是它在体内的使用也存在着许多缺点。在体内,局部高浓度的生长因子长时间的刺激具有潜在的诱变性,由于含有生长因子的组织工程支架材料和替代物制备工艺复杂和储存条件苛刻,都会导致其价格相对较高。为了解决生长因子在临床使用过程中的存在的问题,将一种非直接接触、组织无损伤、价格低廉的电信号刺激与生长因子联合用于组织修复。实验中系统的研究了不同电刺激参数对于细胞增殖、基因表达和ALP分泌的影响,寻找到了适宜组织修复的最佳电刺激参数。电刺激和BMP-2的联合使用结果发现,电刺激能够增强BMP-2介导的细胞向成骨分化。这说明电刺激和BMP-2在细胞向成骨分化的调控中具有协同作用。电刺激与生长因子的联合作用不但能解决单独使用生长因子带来的问题,同时也会增强生长因子促进组织修复的效果。