胆囊癌是最常见的胆道系统肿瘤，占胆道系统肿瘤的80-95％，其发病率近年来呈逐渐上升趋势，最高达21.5/10万[1]，位于消化系统肿瘤的第五位。由于胆囊癌早期无典型症状，大多数患者在就诊时己属于临床中晚期，5年生存率约为5％，中位生存期9.2个月[2]。影响胆囊癌患者预后因素包括胆囊癌易浸润肝脏、肝门等导致根治性手术切除率低，同时胆囊癌细胞对化放疗均缺少敏感性。因此，寻找一种方法提高胆管癌对治疗药物的敏感性，具有非常重要的意义。　　 作为一种1942年Waddington首先提出的概念，表观遗传学引起了越来越多的关注，并逐渐成为阐明基因组功能的关键研究领域，也为研究肿瘤的治疗提出一个全新的方向。目前表观遗传通常被定义为DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变，即基因型未变而表型改变。细胞的基因组中除了DNA、RNA序列以外的调控基因表达信息，其本身不会改变基因序列，但可以通过DNA修饰蛋白质之间以及与DNA分子之间的作用，影响和调节基因功能，并且通过细胞分裂和增殖周期影响遗传。DNA甲基化(methylation)是目前研究得较清楚的一种表观遗传调节。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶(DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸S-adenosyl-methionine，SAM)为供体，将甲基转移至胞嘧啶的过程。在脊椎动物中，胞苷磷酸鸟苷(CpG)二核苷酸是DNA甲基化发生的主要位点。CpG常成簇存在，富含CpG的一段DNA即CpG岛。CpG岛常位于转录调控区附近，DNA甲基化的研究与CpG岛的研究密不可分。　　 5-Fu作为胆囊癌化疗的常用药物，尤其是5-Fu联合LV、ADR、MMC等化疗方案较单药取得了更好的控制率，然而肿瘤细胞与5-Fu长期接触后，在翻译水平上大量合成TS，以及旁路途径均抵消了5-Fu的细胞毒作用。决定5-Fu优先对靶细胞发挥作用的因素是5-Fu代谢的内在生化特征和作用时间的长短。在长时间连续作用的条件下5-Fu影响的DNA生物合成，使细胞增殖停止于S期死亡，起作用的主要是FdUMP。5-Fu还可代谢为FUTP（三磷酸氟尿嘧啶），以伪代谢物的身份参与RNA的合成，干扰RNA的正常生理功能，而后者低浓度就足够了。如果FUTP和FdUMP的最终细胞浓度比有效水平低，可能仅产生它的双重作用之一。其分解代谢的限速酶-DPD对5-FU的代谢具有重要的意义，关系到其疗效和安全性。对猪DPD结构的分析表明，DPD是一种由两个相同亚单位构成的同型二聚体蛋白。每个亚单位由1025个氨基酸组成，相对分子质量为111×103。每个亚单位按其与嘧啶碱或辅酶的结合可分为5个结构域。酶动力学研究表明，DPD通过非经典的两位点“乒乓”机制发挥作用：以两个不同位点分别与NADPH/NADP+和嘧啶碱(或5-FU)结合，NADPH作为供氢体还原FAD后，电子经[4Fe-4S]簇传递至FMN，继而嘧啶碱被还原。DPD蛋白结构的确定，为推测和解释DPD基因突变引起的氨基酸序列改变对活性的影响提供了一定的理论基础。DPD与5-FU疗效体外研究表明，肿瘤细胞中DPD表达和活性与5-FU的治疗敏感性相关，DPDmRNA高表达和DPD高活性可能引起5-FU耐药，反之则导致细胞毒效应明显，对5-FU具有较好的响应。因此，我们期望运用表观遗传学理论在转录后调控水平研究其中部分相关蛋白及酶的对5-Fu耐药的影响。　　 本实验采用real-timePCR分析药物作用细胞后DPD基因mRNA水平变化，采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)对胆囊癌细胞DPD基因启动子区域进行扩增，并测定DPD基因甲基化水平变化。采用western-blot法检测药物作用后DPD蛋白水平变化。　　 实验研究中证实了人类胆囊癌GBC-SD细胞对5-FU耐药，部分原因在于该细胞株在5-FU诱导下DPD蛋白高表达。5-FU代谢的主要限速酶DPD不仅基因mRNA丰度增强，可能转录和翻译等其他环节亦激活，致DPD蛋白高表达。DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR，具有在体外抑制胆管癌细胞增殖、促进细胞调亡的作用，证实联合下调DNA甲基转移酶DNMTI和DNMT3b能使DPD基因启动子区域去甲基化，可诱导DPD基因mRNA复制，但并不导致DPD蛋白增加。5-AZA-C与5-FU联合应用可明显抑制5-FU所致的DPD高表达。表明DPD基因低甲基化(可能位于启动子CpG岛和组蛋白H3-和赖氨酸9)可调控诱导mRNA复制，但在转录后和翻译水平抑制DPD蛋白合成，并阻断5-FU诱导DPD高表达的转录以后途径。　　 研究为进一步明确DNA甲基化酶抑制剂联合作用机制、明确表遗传学变化间的关系奠定了基础，并为利用表遗传学方法治疗胆管癌提供了实验依据。通过表观修饰治疗，患者可能对化疗、干扰素、免疫治疗更具敏感性。