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目的1.考察食管癌细胞耐药之后自噬水平的变化,以及自噬与细胞上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transformation,EMT)之间的关系,探究食管癌耐药以及其诱发转移的新机制。2.探究SIRT1对食管癌耐药细胞自噬和EMT的调控。3.考察SIRT1抑制剂对体内肿瘤生长的影响,确证体内相关机制。方法1.采用MTT法检测食管癌耐药细胞TE-1/PTX、EC109/PTX的耐药指数;通过形态学观察的方法比较食管癌亲本细胞与耐药细胞的形态学差异。2.利用透射电子显微镜观察食管癌细胞耐药后自噬小体及自噬溶酶体数量的变化;采用Western Blotting和免疫荧光实验考察食管癌细胞耐药后自噬相关蛋白表达的变化。探究食管癌细胞耐药后自噬水平的变化。3.通过划痕、Transwell实验检测细胞耐药后迁移能力的变化;采用划痕、Transwell、Western Blotting、免疫荧光实验考察自噬抑制剂对食管癌耐药细胞迁移能力以及EMT相关蛋白的影响。探究食管癌细胞耐药后自噬和EMT的关系。4.通过SIRT1抑制剂和SIRT1 siRNA干预两种方式干扰SIRT1表达,采用细胞划痕和Transwell实验检测SIRT1对于耐药细胞迁移能力的作用;利用透射电子显微镜观察SIRT1对耐药细胞自噬小体及自噬溶酶体的影响;利用Western Blotting和免疫荧光实验检测SIRT1对于耐药细胞自噬及EMT相关蛋白表达的影响。考察SIRT1对耐药细胞中自噬和EMT的调控。5.通过食管癌耐药细胞TE-1/PTX裸鼠移植瘤模型,考察SIRT1抑制剂对裸鼠肿瘤生长的影响;利用免疫组化实验确证SIRT1抑制剂影响耐药细胞体内生长的作用机制。结果1.食管癌耐药细胞TE-1/PTX、EC109/PTX的耐药指数分别为8.456、11.602,为中度耐药;与亲本细胞相比,食管癌耐药细胞变得狭长,伸出伪足,胞间连接增多。2.食管癌细胞发生耐药后,细胞中自噬小体及自噬溶酶体的数量显著增多;自噬相关蛋白表达增加,LC3II、Atg7、Beclin1蛋白表达上升,P62蛋白表达下降。3.食管癌细胞发生耐药后,迁移能力增加,使用自噬抑制剂可以抑制食管癌耐药细胞的迁移,降低耐药细胞中Snail、N-Cadherin、Vimentin蛋白表达水平,升高ZO-1、E-Cadherin的蛋白表达水平。4.抑制SIRT1可以减少耐药细胞中自噬小体及自噬溶酶体的数量,抑制耐药细胞的自噬水平,影响自噬相关蛋白表达水平,使P62表达水平增加,LC3II、Atg7、Beclin1的表达水平下降;进一步影响EMT相关蛋白的表达,使间质相关蛋白Vimentin、N-Cadherin的表达水平降低,上皮相关蛋白E-Cadherin的表达水平升高。5.食管癌耐药细胞裸鼠移植瘤模型实验结果显示,SIRT1抑制剂组较对照组耐药细胞的瘤体积与瘤重受到明显抑制,并且体重无明显变化;肿瘤组织的免疫组化实验结果显示,SIRTl抑制剂组较对照组相比自噬相关蛋白LC3II表达降低,P62表达升高;上皮相关蛋白E-Cadherin的表达升高,间质相关蛋白N-Cadherin的表达降低。结论1.食管癌细胞产生耐药后,自噬水平升高,促进EMT进程,促进肿瘤细胞的迁移。2.抑制SIRT1可以降低食管癌耐药细胞的自噬水平,干预EMT进程,抑制肿瘤细胞迁移。3.在食管癌耐药细胞裸鼠移植瘤模型中,SIRT1抑制剂可以抑制耐药肿瘤的生长,其体内机制可能与抑制耐药肿瘤组织中的细胞自噬,干预EMT进程有关。