当前疟疾依然是世界上危害最为严重的三大传染病之一,疟疾的病原体是疟原虫,其生活史包括肝期、红内期和蚊期,疟疾主要的传播方式为按蚊叮咬感染人体,进入肝脏和血液,从而引起一系列临床症状[1]。红内期是疟原虫致病致死的主要时期,当前主要的治疗性药物为青蒿素及其衍生物[2-4],但近年有文献表明,青蒿素及其衍生物已经在东南亚地区产生了不同程度的耐药性,因此迫切需要研发新的红内期抗疟药物[5,6]。由于疟原虫的虫源蛋白激酶与宿主蛋白激酶序列同源性存在很大差异,且近年来一系列研究证实,众多虫源蛋白激酶在疟原虫的致病传播过程中发挥非常重要的作用[7-13],因此是设计抗疟药的理想获选靶标[14]。通过生物信息学方法的筛选,我们得知PK9是一种重要的虫源蛋白激酶,PK9在红内期的表达明显高于其他时期,有可能在红内期发挥着重要作用。然而到目前为止,对PK9的在红内期疟原虫生长发育和免疫逃避中的作用和机制研究仍然空白[15,16]。鉴此,本课题拟筛选和鉴定影响红内期疟原虫发育的蛋白激酶,并将筛选出的PK9(protein kinase PK9),并通过CRISPR-Cas9技术进行敲除[17],初步探讨PK9缺失后对疟原虫生长发育和宿主免疫的影响,并且探究其背后的机制,从而为设计有效的新型抗疟药物提供重要的理论依据。一、PK9缺失后P.y 17XL疟原虫红内期毒力减弱1、通过CRISPR-Cas9技术构建PK9敲除的疟原虫通过生物信息学的方法,查找到PK9的结构、序列、同源性及表达情况等相关信息。采用CRISPR-Cas9的技术,构建了PK9 KO重组质粒,并将该质粒进行电转进入约氏疟原虫P.y 17XL,随后将电转后的虫子腹腔注射感染BALB/c小鼠,通过药物筛选及克隆最终获得纯的PK9 KO的疟原虫克隆株。2、PK9 KO疟原虫株毒力明显下降将WT虫株和PK9 KO感染BALB/c小鼠后,观察对比疟原虫原虫血症变化及被感染的小鼠生存曲线。结果显示:PK9 KO的疟原虫在红内期的生长发育相对WT的原虫显著缓慢,原虫率显著下降,致死率显著降低。二、PK9敲除后引起虫株毒力下降的机制初探1、PK9缺失不引起宿主对疟原虫的免疫应答改变将PK9 KO虫株和WT虫株分别用于先天免疫缺陷且T、B淋巴细胞缺失的重症联合免疫缺陷的NOD/SCID小鼠[18]及普通的BALB/c小鼠,观察并记录原虫血症及生存曲线。结果显示:PK9 KO组原虫率及生存情况与WT组相比依然存在显著差异,但在SCID小鼠和BALB/c小鼠体内并无显著差异,说明PK9 KO后并不影响宿主对疟原虫的免疫应答变化。2、PK9对17XL红内期疟原虫入侵的选择性无明显影响将PK9 KO虫株和WT虫株分别感染BALB/c小鼠,观察记录感染及未被感染的网织红细胞占被感染的红细胞的的比例。结果显示:WT虫株和PK9 KO虫株对网织红细胞感染率无显著差异,说明PK9不影响疟原虫入侵红细胞的选择性。3、PK9对17XL红内期疟原虫各阶段的发育无显著影响观察计数WT虫株和PK9 KO虫株分别感染BALB/C小鼠24h后,每隔8个小时的血涂片中各个时期疟原虫的数量变化。结果显示:WT组和PK9 KO组各形态疟原虫占比无显著差异,PK9敲除后也并不能阻断疟原虫某一时期的发育。4、PK9敲除后的17XL红内期疟原虫晚期裂殖体内裂殖子数目减少在将PK9 KO获得的虫株和WT虫株感染BALB/c小鼠48h后,取眼球血进行同步化到裂殖体时期,观察和计数晚期裂殖体内的裂殖子数量并进行对比。结果显示:PK9KO的虫株裂殖子数量明显低于WT虫株,提示PK9可能影响疟原虫的裂殖子增殖过程。5、PK9影响泛素化过程对PK9 KO和WT虫株分别作DAPI和泛素化免疫荧光,并进行共聚焦观察。结果显示:PK9 KO的虫株感染红细胞后,泛素化荧光和DAPI很少重叠,而WT的虫株里有明显重叠,提示PK9 KO后可能影响了泛素化过程。三、PK9 KO疟原虫感染小鼠自愈后获得免疫保护感染了17XL PK9 KO虫株的BALB/c小鼠在大约18天左右清除了虫子,30天后,再次腹腔注射10~5个P.y 17XL进行攻击,结果显示:PK9 KO清除后的自愈小鼠受到WT虫株攻击后疟原虫无法生长,而感染WT虫株的对照组正常小鼠均在5天左右死亡。提示PK9 KO疟原虫感染小鼠自愈后获得免疫保护,也提示PK9 KO虫株可能作为潜在的遗传减毒疟疾疫苗。本研究首次发现PK9在疟原虫红内期生长发育中的作用,并初步探讨了PK9对疟原虫自身及宿主免疫应答方面的机制,为研究新的红内疟原虫阻断策略提供新的靶点及理论依据。另外,本实验探索了PK9 KO虫株的应用前景,即PK9敲除后毒力减弱的虫株是否可以作为一种潜在的遗传减毒疫苗,以应用于临床工作中治疗和预防疟疾。