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季节性流感与爆发性大流感在过去曾引起严重的死亡及致病率。在针对严重的流感感染后治疗的方案中,曾经有将康复病人的血清处理后回输至患者体内,从而达到治愈的目的。尽管这一方法明确有效,但是从广泛应用的角度来讲,从有限的康复病人体内得到的高亲和力中和抗体毕竟难以应对大流感的爆发,而且并不是随时随地能遇到这样的康复病人。 本实验通过携带流感病毒表面血凝素蛋白的腺病毒疫苗免疫恒河猴后,使其体内产生相应的中和抗体,并且通过三次免疫对B细胞的刺激,促进高亲和力抗体的产生,之后我们从恒河猴外周血分离B细胞,并以其RNA为来源,逆转录后构建噬菌体展示抗体免疫库。从构建好的抗体免疫库中,我们筛选到3株中和抗体,对其进行了体外中和特性分析,并且选择两株检测了体内保护活性。 体外分析结果显示:Western Blot结果提示4E6中和抗体能结合H5亚型三株不同H5N1流感病毒(A/Hong Kong/482/97,A/Vietnam/1194/04,A/ZheJiang/16/06),结合位点在HA1片段,与HA2不结合。4D5与1H10不识别线性表位。血凝抑制和微量中和结果显示,中和抗体能够交叉中和三株不同的H5N1病毒,同时以4E6中和滴度最高。表面等离子共振实验与中和实验结果一致,以4E6中和抗体的亲和力最高,达到约22pM。 体内保护实验采用10LD50剂量的A/Vietnam/1194/04病毒攻毒BALB/c小鼠,分别于攻毒后24小时、48小时和72小时给与10mg/kg剂量抗体(4E6、1H10)单次治疗。生存曲线显示,4E6在24或48小时给药能完全保护小鼠,72小时给药保护率85%,肺脏病毒滴定均在检测范围外,即无法检测到活病毒。1H10在三个时间点给药保护率均为85%,肺脏病毒滴定均能测到活病毒,但与阴性对照给药组有明显差异。 本研究通过噬菌体展示技术从免疫抗体库筛选到的针对H5亚型流感病毒高亲和力中和抗体为临床治疗高治病性禽流感提供了有效的依据与参考。