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红霉素(erythromycin)是糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)合成的次生代谢产物,为一类广谱大环内酯类抗生素,在临床上具有广泛的应用。第三代红霉素增强了红霉素的酸稳定性,而且对许多耐药性细菌具有杀死或抑制作用,其结构上的最大特点是内酯环C-3位的L-克拉定糖为酮基所取代,又被称为酮内酯类抗生素(ketolide)。红霉素母核中C-3位的功能基团-OH由其聚酮合成酶(polyketide synthase,PKS)模块6中的酮基还原酶(ketoreductase，KR)酶域决定,用基因工程方法对KR6酶域的DNA序列进行敲除或替换可能会全部或部分地使KR6失活,使C-3位羟基变为酮基。 在糖多孢红霉菌KR6酶域的NADPH结合保守区域中有两个重要氨基酸GlyAla1142.本文通过同源重组方法突变KR6酶域的GlyAla1142密码子,构建可以合成DOEB而不产生红霉素的糖多孢红霉菌A226突变体,为下一步筛选有生物活性的酮内酯类抗生素奠定了基础。 以糖多孢红霉菌基因组DNA为模板,利用反向PCR技术,扩增糖多孢红霉菌KR6酮还原酶基因突变DNA片段SP(KR6酶中GlyAla1142替换成SerPro),克隆到载体pWHM3上,构建染色体同源重组型质粒pWHM3-SP。在PEG3350-T缓冲液介导下将pWHM3-SP转化到糖多孢红霉菌A226原生质体中,筛选出pWHM3-SP整合到红霉素合成基因上的整合体A226-1、A226-2和A226-3.将筛选得到的整合体A226-1在无硫链丝菌肽的R3M斜面上至少生长两代后,制备成原生质体涂R3M平皿,对不能在含Thio的R3M斜面上生长并无枯草杆菌抑制效应的菌株进行DNA序列分析,获得了糖多孢红霉菌A226的突变菌株A226-SP。高分辨液像色谱-质谱联用分析仪分析证实A226-SP突变体合成了DOEB,同时检测到红霉素母环合成过程中模块5中ACP的底物C18H34O6,但没有发现红霉素产物。 为了验证是因为突变KR6酶域的GlyAla1142密码子而使KR6失活,设计了回复实验,来证明二次重组没有改变除已测序之外其它DNA的结构。根据密码子的偏好性,将编码Gly的密码子由GGT变为GGC保证编码产物不变,构建了同源重组型质粒pWHM3-CA,在PEG3350-T缓冲液介导下转化糖多孢红霉菌A226-SP的原生质体。通过两次同源重组筛选,挑取了1株能够恢复抑制枯草芽孢杆菌生长的菌株,薄层层析证明该菌株能够恢复合成红霉素的功能。说明整个重组过程没有破坏糖多孢红霉菌A226染色体的其他合成基因和后修饰基因结构。