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本研究以家蚕57限品种为材料,用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分离其血清与生殖腺总蛋白,旨在了解家蚕主要蛋白质在其生长发育过程中的变化情况,同时建立家蚕4龄、5龄和蛹期的血清及生殖腺蛋白质的连续表达的SDS-PAGE图谱;用双向凝胶电泳方法分离家蚕生殖腺总蛋白,筛选家蚕性别之间、发育过程中的特异性蛋白点。用蛋白质组学方法研究、探讨家蚕性别控制以及发育变态的调控机制。主要结果如下:
1.用Bradford法测定了家蚕4龄血清中的蛋白含量,表明其含量随着蚕的生长发育而逐渐增加。经SDS-PAGE分析,从4龄雌蚕血清中分离到22个不同分子量的蛋白组分,雄蚕中分离到21个不同的组分,从起蚕到眠,自始至终存在的组分雌蚕有15个;雄蚕有18个。
2.家蚕5龄期的血清蛋白含量,伴随着蚕的生长发育而显著增加。对5龄血清蛋白进行SDS-PAGE分析后发现,雌蚕有20个不同分子量的蛋白组分,雄蚕有19个组分。5龄期内都存在的蛋白组分雌蚕有12个;雄蚕有15个。
3.蛹期的血清蛋白含量,随着蛹向蛾的发育变化过程,血清蛋白含量逐渐减少。经SDS-PAGE分析,雌蛹血清中共检测到15个不同分子量的组分,雄蛹中检测到23个组分。蛹期内雌雄一直存在的组分分别有8个和12个。
4.对雄蚕生殖腺蛋白进行SDS-PAGE分析,5龄生殖腺中共检测到24个不同分子量的蛋白组分,蛹期检测到18个不同的组分,蛾期有25个不同的组分。5龄、蛹期和蛾期一直存在的蛋白组分分别有15个、7个和10个。
5.对雌蚕生殖腺蛋白进行SDS-PAGE分析,蛹期共检测到22个不同分子量的蛋白组分,蛾期检测到24个不同的组分。蛹期和蛾期内一直存在的蛋白组分分别有12个和10个。
6.用双向凝胶电泳的方法对家蚕蛹第2天的雌雄生殖腺蛋白进行分离,经ImageMaste,M2DPlatinum5.0软件分析,在雄性生殖腺蛋白的电泳图谱中共检测到435个蛋白质斑点,其中特异性蛋白斑点73个,占总蛋白点数的16.8%。雌蚕生殖腺的电泳图谱中有417个蛋白质斑点,其中特异性蛋白斑点55个,占总蛋白点数的13.2%。雌雄能匹配的蛋白点有362对,匹配率达到85.0%。
7.雄蛹生殖腺蛋白经2-DE分析,在蛹期第1天的蛋白2-DE图谱中,检测到362个斑点,其中特异性蛋白斑点36个,占总蛋白点数的9.9%。在第3天的电泳图谱中检测到372个蛋白质斑点,其中特异性蛋白斑点46个,占总蛋白点数的12.4%。第1、3天能匹配的蛋白点有326对,匹配率为88.8%。
8.对蛹期第1、2、3天雌生殖腺蛋白的2DE图谱进行分析,第1天检测到164个蛋白质斑点,其中特异性蛋白斑点55个,占总蛋白点数的33.5%。第2天检测到232个蛋白质斑点,其中特异性蛋白斑点30个,占总蛋白点数的12.9%。第3天有214个蛋白质斑点,其中特异性蛋白斑点43个,占总蛋白点数的20.1%。
9.提取雌蛹第1天发现的差异蛋白点Xl,经串联质谱分析鉴定,所得到的肽序列为:K.DDLTYLDSDMLVK.R,K.DLGMSNTSK.T,K.FADVMIYR.K,K.TVDTSEMVMMK.D,K.TVDTSEMVMMKDDLTYLDSDMLVK.R,R.TGMLLPTLDMTMMK.D,蛋白分子量为:87241.36Da,等电点为6.78。经搜索比对,认为是一种性别特异性储存蛋白(Sex-specificstorage-protein1precursor)。