海洋微生物中脂肪酶/酯酶及耐热超氧化物歧化酶的应用研究

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脂肪酶、酯酶和超氧化物歧化酶均是重要的工业用酶,脂肪酶、酯酶的立体选择性常被用来制备手性药物及其中间体,耐高温超氧化物歧化酶被广泛应用于食品、化妆品和医药行业。本研究从海洋来源的细菌中克隆、表达和定性了两个新颖的脂肪酶/酯酶,它们都具有手性拆分功能,另外从两株海洋来源的耐高温细菌中克隆、表达和定性了两个超氧化物歧化酶。  本研究从囊孢菌Dactylosporangium aurantiacum sub sp.hamdenensis NRRL18085基因组中获取了一个新颖的酯酶DAEst6。经多态性分析,DAEst6属于脂水解酶第Ⅶ家族。酯酶DAEst6能够通过催化扁桃酸甲酯不对称的水解反应生成重要的手性药物中间体——(R)-扁桃酸甲酯。通过条件优化,DAEst6催化扁桃酸甲酯不对称水解的最佳条件为:10mM外消旋扁桃酸在50μgDAEst6纯酶作用下,于pH7.5缓冲液(50mM,Tris-HCl)中,40℃反应5h,可获得光学纯度为99%的(R)-扁桃酸甲酯,转化率为49%。本文是第一个定性囊孢菌脂肪酶/酯酶的文献,并成功地利用囊孢菌酯酶进行手性药物中间体的制备。  MT6是从南中国海来源的微生物Marinactinospora thermotolerans SCSIO00652中分离鉴定的一个脂肪酶,经多态性分析和序列比对MT6属GDSL家族。MT6和Nocardiopsis dassonville中的一个假定脂肪酶有59%的相似度,实验对重组脂肪酶MT6进行了研究。MT6能够通过转酯反应生成(R)-1-苯乙醇,并且立体选择性出色,生成的(R)-1-苯乙醇光学纯可达99%,底物1-苯乙醇转化率为54%。之前关于利用GDSL脂肪酶进行手性拆分的研究非常少,此文是第一个用GDSL脂肪酶制备手性1-苯乙醇的文献,而且与大多数脂肪酶不同的是,产物的构型是相反的。因此脂肪酶MT6具有巨大的工业应用价值。  由于MT6的立体选择性和多数脂肪酶是相反的。本文接下来研究了MT6通过水解反应制备(S)-1-苯乙醇。通过反应条件的优化,如温度、有机共溶剂、pH、离子强度、酶用量、底物浓度及反应时间等等,可以获得光学纯度为97%的(S)-1-苯乙醇,转化率可达28.5%。通过水解不同侧链长度的1-苯乙醇酯实验,发现乙酸苏合香酯是MT6最佳的水解底物。  Bacillus sp.SCSIO15121和Bacillus sp.SCSIO15029是从南中国海沉积物中分离的两个耐高温菌,本研究分别从15121和15029中鉴定了两个SOD酶——SODBa3和SODBa6。SODBa3和SODBa6都是由609bp的碱基构成,对应着202氨基酸残基。通过构建pET28a(+)-SOD表达载体,实现了SODBa3和SODBa6在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中可溶性异源表达。对这两个重组蛋白基本酶学性质研究表明,SODBa3最适pH为8.0~8.5,最适反应温度为60℃,比酶活为3215.6U·mg-1。5mMMn2+能够促进SODBa3酶活。而SODBa6最适pH为7.5,最适反应温度为40℃,比酶活为5511.46Umg-1。SODBa3和SODBa6对H2O2均不敏感,但对CH3Cl-C2H5OH却很敏感,说明SODBa3和SODBa6是Mn-SOD。SODBa3和SODBa6的热稳定性质均较好,尤其是SODBa3,它能在100℃处理1h后还保有50%的酶活,实验进一步通过圆二色谱确认了SODBa3是个热温度性能出色的Mn-SOD。
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