本课题研究的目的： 1、采用Elivision二步免疫组化法检测慢性乙型肝炎、慢性重型肝炎患者及正常对照组肝组织TLR2和TLR4的表达，分析其与慢性乙型病毒性肝炎肝组织的炎症活动度及相关临床指标的关系； 2、采用流式细胞技术和实时荧光定量RT-PCR分别在蛋白水平及mRNA水平检测肝癌细胞株HepG2，HepG2-X和HepG2.2.15的TLR2和TLR24表达，初步探讨乙型肝炎病毒及其成分对肝细胞表达TLR2和TLR4的影响； 3、采用Elivision二步免疫组化法检测原发性肝癌癌组织和配对癌旁组织及正常肝组织TLR2、TLR4的表达，分析其与临床病理因素的关系，初步探讨TLR2，TLR4在原发性肝癌免疫反应中的参与作用。 第1章.TLR2和TLR4在慢性乙型肝炎患者肝组织上的表达。 材料和方法： 2003年6月至2006年5月中山大学附属第三医院部分住院病人共90例，男性84例，女性6例，中位年龄35(16～53)岁，其中慢性乙型肝炎组(chronichepatitis B，CHB)为肝穿刺标本，75例，慢性重型肝炎组(chronic severe hepatitis，CSH，乙型)15例，为肝移植病肝切除标本，诊断符合2005年《慢性乙型肝炎防治指南》及2000年《病毒性肝炎防治方案》。另设正常对照组，标本取自肝移植移植肝常规留取标本，10例，均为男性，排除乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)或其它病毒感染。 所有标本常规石蜡包埋，切片，苏木素.伊红染色、网状纤维染色及HBsAg、HBeAg免疫组化染色(SABC法)以协助诊断。肝脏炎症病理分级根据2000年修订的病毒性肝炎防治方案中有关慢性病毒性肝炎病理炎症程度分级(G)标准进行分级，分为G0～G4。乙型肝炎患者收集乙肝二对半、HBV-DNA定量、肝功能、PT及PTA、肝纤维化指标等临床资料。待测病理切片采用Elivision二步法进行免疫组化染色，具体步骤参照试剂盒推荐步骤进行，第一抗体为抗TLR2多克隆抗体、抗TLR4多克隆抗体，稀释度为1：100，DAB显色，用柠檬酸微波法进行抗原修复，设立阴性对照，以PBS代替一抗。免疫组化结果判断采用综合评分法分为-、+、++、+++四级，分析其与慢性乙型病毒性肝炎肝组织的炎症活动度及相关临床指标的关系。 第二章.肝癌细胞株.HepG2，HepG2-X和HepG2.2.15的TLR2和TLR4表达。 材料和方法： 肝癌细胞株HepG2及HepG2.2.15(HepG2转染乙型肝炎病毒全病毒基因组形成)为中山大学附属第三医院传染科实验室保存，肝癌细胞株HepG2-X为HepG2转染乙型肝炎病毒X基因组形成，已由中山大学附属第三医院传染科杨林教授前期建立并保存。 TLR2、TLR4蛋白水平的表达：常规培养并收集细胞，采用直接免疫荧光流式细胞术检测TLR2、TLR4在肝癌细胞株HepG2、HepG2-X及HepG2.2.15上表达的平均荧光强度(MFI)及阳性细胞率，抗体为FITC-anti-TLR2和PE-anti-TLR4抗体，以FITC-mouse IgG 2a和PE-mouse IgG 2a代替抗体作为同型对照。TLR2、TLR4 mRNA水平的表达：取中山大学附属第三医院传染科实验室建立并保存的pBluescript-HBV质粒，1：10倍比稀释作为标准品，进行荧光定量PCR反应，以其Ct(域值循环数，threshold cycle)值与不同浓度标准品的对数值拟合作图，建立标准曲线。Trizol法提取三株细胞总RNA，采用SYBR GreenI嵌合荧光法进行实时一步RT-PCR反应，根据标准曲线，软件自动计算出待测样本中TLR2，TLR4和内参β-actin的mRNA含量，以TLR2，TLR4 mRNA和β-actin mRNA含量的比值作为评价TLR2，TLR4表达水平的指标。TLR2，TLR4和β-actin PCR扩增产物抽样经2％琼脂凝胶电泳鉴定。 第三章.TLR2，TLR4在原发性肝癌中的表达。 材料和方法： 63例原发性肝癌患者均为2005年1月至2006年2月中山大学附属第三医院住院行肝移植或常规手术切除病人，术后病理证实均为肝细胞癌，血清学证实有乙型肝炎病毒感染，年龄27～62岁(中位年龄44岁)，其中男性52例，女性11例，取肿瘤组织及癌旁相对正常组织，并取肝移植移植肝常规留取标本作为正常对照组。 所有患者收集以下临床资料：乙肝二对半、AFP定量、肝功能(评为Child-pughl，2，3级)、癌的大小(<5cm，≥5cm)，个数(单个，多个)，局部淋巴节转移(有，无)，门静脉分支癌栓(有，无)。 待测标本常规石蜡包埋切片，采用Elivision二步法进行TLR2，TLR4染色，方法同第1部分乙型肝炎肝组织TLR2、TLR4免疫组织化学染色，采用综合评分法，肿瘤区及非肿瘤区各自评分方法同第1部分，然后分析TLR2、TLR4的表达与各项临床指标的关系。 结论： TLR2和TLR4在慢性乙型病毒性肝炎及慢性重型肝炎患者肝组织上的表达明显高于正常对照组，并且二者的表达强度与肝组织炎症活动度分级(G)呈显著正相关，结合前期实验慢性乙型病毒性肝炎患者外周血单个核细胞中，TLR2的表达明显的升高并与TNF-a呈正相关，提示TLR2和TLR4(特别是TLR2)与乙型病毒性肝炎的关系密切并且可能在慢性病毒性肝炎的免疫损伤中起较重要作用。 2 HepG2.2.15细胞上TLR2和TLR4的表达明显高于HepG2和HepG2-x，而HepG2和HepG2-X细胞TLR2和TLR4的表达无显著性差异，说明乙型肝炎病毒可直接上调TLR2和TLR4的表达，而其成分X基因或蛋白对TLR2和TLR4的表达无作用，间接说明乙型肝炎病毒对TLR2和TLR4的上调可能是通过非X基因或蛋白来完成的。 3 原发性肝癌组织及其癌旁组织，TLR2和TLR4的表达均明显高于正常肝组织，而肝癌组织TLR2和TLR4的表达与癌旁组织相比受到相对抑制，门静脉分支癌栓的患者癌组织TLR4的表达强度低于无门静脉分支癌栓的患者，提示TLR2和TLR4参与了原发性肝癌疾病过程中的免疫反应。