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目的:体外诱导人牙髓细胞(Human dental pulp cells,h DPCs)成牙本质细胞向分化,模拟牙本质形成过程,检测矿化过程耐高温丝氨酸蛋白酶A1(High-temperature requirement protein A1,HtrA1)及TGF-β1/Smad信号相关因子的表达情况,进一步检测HtrA1抑制对此矿化过程及TGF-β1/Smad信号的影响,探索HtrA1在hDPCs成牙本质细胞向分化过程中对TGF-β1/Smad信号通路表达的影响,探索牙髓保护及修复性牙本质形成的具体机制,为寻求临床上牙髓保护性治疗提供新的思路和理论依据。方法:1、体外培养鉴定h DPCs,经矿化诱导建立hDPCs向成牙本质细胞分化的矿化模型,根据矿化时间分为0天、7天、14天、21天、28天组,茜素红染色检测矿化结节形成情况、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性测定、RT-PCR检测矿化相关因子ALP、Ⅰ型胶原(Collagen typeⅠ,COLⅠ)及成牙本质细胞标志因子牙本质涎磷蛋白(Dentin sialophosphoprotein,DSPP)mRNA的表达以验证体外矿化模型成功建立。RT-PCR方法检测矿化诱导过程中h DPCs内HtrA1及TGF-β1/Smad信号相关因子TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad4、Smad6和Samd7的表达情况。2、构建HtrA1基因shRNA(short hairpin RNA)慢病毒载体,包装后感染人牙髓细胞,嘌呤霉素稳定筛选,检测感染后基因干扰效果,绘制细胞生长曲线,观察感染细胞生长增殖潜力。病毒感染细胞矿化诱导21天,于不同时间检测矿化结节形成情况、ALP活性测定、矿化相关因子ALP、COLⅠ及dsppmrna的表达变化情况。同时检测htra1及tgf-β1/smad信号相关因子tgf-β1、tβrⅠ、tβrⅡ、smad2、smad4、smad6和samd7的表达变化情况。结果:1、牙髓细胞传至第3代,形态均一,呈典型成纤维细胞长梭形。免疫组化检测结果显示波形蛋白染色呈阳性着色,角蛋白染色呈阴性着色,提示该细胞为间充质来源。rt-pcr结果显示在矿化诱导过程中随时间的延长矿化结节形成持续增多、alp活性升高、alp、colⅠ及dsppmrna表达逐渐升高。htra1mrna表达在矿化诱导第7天达最高峰,随后逐渐减弱;tgf-β1mrna表达从第7天开始升高,呈时间依赖性上调,第21天达到高峰。tβri和tβriimrna的表达趋势与tgf-β1一致;smad2与smad4mrna的表达于第14天开始升高,在第21天达到高峰;smad6及smad7mrna表达在矿化诱导的前14天无明显变化,于第21天升高并维持在较高水平。2、慢病毒感染牙髓细胞4天后,空白对照组(blank组)无绿色荧光阳性细胞,而阴性对照组(nc组)和htra1抑制组(shhtra1组)表达绿色荧光的细胞约60%,经嘌呤霉素稳定筛选两周后可达95%以上。经稳定筛选后,rt-pcr结果显示blank组与nc组的htra1mrna的表达水平无明显差异;shhtra1组的htra1mrna及蛋白表达均显著低于nc组。生长曲线绘制结果显示blank组、nc组及shhtra1组的细胞生长趋势相同。与nc组相比,htra1抑制后,矿化诱导过程中矿化结节形成减少,alp活性下降,矿化相关因子alp、colⅠmrna表达显著降低,dsppmrna表达亦显著下降。htra1抑制后tgf-β1mrna表达随之下降,其下游各因子tβrⅠ、tβrⅡ、smad2、smad4、smad6及smad7mrna表达水平较nc组低。结论:htra1、tgf-β1及其受体的表达在hdpcs的成牙本质细胞向分化过程中上调,下游因子smad2、smad4表达同步增加,通路抑制因子smad6和smad7的表达亦在上游因子表达高峰时期增加。而htra1抑制能影响hDPCs向成牙本质细胞分化的过程,降低矿化相关因子的表达;同时TGF-β1/Smad通路各因子表达均下调,我们推测HtrA1可能通过上调TGF-β1的表达,激活TGF-β1/Smad信号正向调节人牙髓细胞的成牙本质细胞向分化。