呼肠孤病毒科成员能在病毒感染细胞中形成典型的病毒加工厂或称为包涵体的特化结构。研究表明，哺乳动物呼肠孤病毒(Mammalian orthoreoviruses，MRV)和禽呼肠孤病毒(Avian orthoreovirus，ARV)非结构蛋白μNS和σNS在病毒包涵体的形成及病毒颗粒的组装中起着极其关键的作用，其中μNS具有招募其他病毒蛋白到其包涵体结构中的能力。序列同源性分析表明，水生呼肠孤病毒(Aquareovirus)的代表株草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)非结构蛋白NS80和NS38分别与MRV，ARV的μNS和σNS蛋白具有很高的同源性。因此，研究NS80和NS38的功能对于进一步揭示水生呼肠孤病毒包涵体的形成机制及病毒的复制和组装具有重要的意义。　　 为探讨水生呼肠孤病毒的致病机理，本论文主要开展了水生呼肠孤病毒包涵体形成的分子机制及与包涵体形成相关的功能域定位研究。此外，本论文还采用杆状病毒双表达系统，进行了GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7的体外共表达，其结果将为进一步研究GCRV入侵细胞的分子机制奠定基础。　　 本论文共分为四章:　　 第一章:呼肠孤病毒简介。简要介绍了呼肠孤病毒的发现和分类命名、形态结构、理化性质及病毒复制组装等研究背景，重点概述了呼肠孤病毒与复制、包涵体形成相关的重要蛋白μNS及其同源蛋白在病毒包涵体形成过程中的功能以及与其他病毒蛋白的相互作用，并结合本领域近年来国内外相关研究进展，阐明了本论文的研究目的和意义。　　 第二章:Aquareovirus非结构蛋白NS38的特性研究。NS38为水生呼肠孤病毒GCRV的非结构蛋白，序列同源性比对分析结果表明，NS38可能与病毒包涵体的形成以及与病毒RNA相互作用方面起着关键性的作用。为研究NS38蛋白在GCRV复制复合体中的作用，制备针对NS38的特异性蛋白抗体显得十分必要。本论文的第二章在对NS38蛋白的原核表达、多克隆抗体的制备及抗体的效价与特异性检测等分析基础上，进行了NS38蛋白的特性分析。　　 第三章:Aquareovirus非结构蛋白NS80及与包涵体形成相关的功能域的研究。在本实验室对包涵体形成的相关蛋白NS80及NS38特性研究基础上，本论文第三章利用免疫荧光的方法，在病毒感染的不同时间观察细胞内包涵体的形态变化，发现在病毒感染细胞后，随着时间的推移，病毒包涵体不断变大，并有向核周移动的趋势。转染实验表明，单独表达的NS80蛋白就可以在转染细胞中形成与病毒感染细胞中类似的包涵体结构，而单独表达的NS38或结构蛋白VP4都不能形成包涵体结构。免疫荧光和免疫共沉淀实验发现NS80可以招募NS38和VP4至包涵体结构中。此外，和泛素蛋白共定位实验表明，包涵体的形成不是由于蛋白错误折叠导致的。为了研究包涵体的形成与细胞骨架微管蛋白之间的关系，使用微管抑制剂Nocodazole处理细胞，使微管解聚，结果发现无论是在病毒感染还是NS80转染的细胞中，包涵体的形态和分布都不受影响，表明包涵体的形成不依赖于细胞的微管骨架系统。　　 为了进一步精确定位NS80与包涵体形成相关的结构域，首先利用生物信息学手段，对NS80蛋白的二级结构进行了分析，结合已有的文献报道，推测蛋白C端的coiled-coil结构域对其包涵体的形成起到决定作用。通过构建一系列NS80 C末端缺失体及进行转染实验，结果发现，NS80 C端4个氨基酸的缺失就会导致包涵体形成能力的丧失。进一步的研究发现，NS80蛋白C末端691-742位氨基酸的功能能被外源的GFP所替代，推测可能与GFP蛋白的二聚化有关。此外，结合N端缺失突变体的实验结果，我们确定了NS80包涵体形成的最小区域为530-742位氨基酸区域。同时，我们还发现，随着N端的不断截短，包涵体的形态由大的颗粒状变成小的核内包涵体，最后到全细胞散在分布不能形成包涵体结构，有趣的是，这种核包涵体可以和细胞内核相关蛋白β-catenin共定位。进一步对NS80 coiled-coil结构域保守位点的突变体研究表明，His569和Cys571保守位点都对包涵体的形成具有至关重要的作用。第三章的结果表明，Aquareovirus NS80具有形成包涵体功能，并能招募结构蛋白VP4及非结构蛋白NS38到其包涵体结构中，其NS80 coiled-coil结构区域及C末端结构对病毒包涵体的形成至关重要。　　 第四章:Aquareovirus外衣壳蛋白VP5和VP7的体外共表达。通过PCR扩增，分别得到编码外衣壳蛋白VP5与VP7的特异性基因片段s6和s10。将s6及s10基因插入pFastBac Dual载体，获得了重组载体pFbDGCRV s6/s10。利用点突变试剂盒，构建了VP5N42A突变的pFbDGCRV s6M/s10表达载体。转座后，经蓝白斑筛选，分别获得了AcGCRV-s6/s10、AcGCRV-s6M/s10重组Bacmid。重组Bacmid转染Sf9昆虫细胞后，通过免疫荧光及Western blot实验，都表明重组GCRV外衣壳蛋白在Sf9昆虫细胞中得到了高效表达。传代发现，病毒滴度逐步上升，5代以后趋于稳定。以上结果表明，我们获得了高效表达GCRV外衣壳蛋白的重组杆状病毒vAcGCRV-VP5/VP7和vAcGCRV-VP5N42A/VP7。最后，分析Western blot蛋白条带，发现VP5蛋白42位点突变后，蛋白不再形成一大一小两条带，而是只有一条大分子量的条带，推测此位点突变后，VP5蛋白不再能发生自动裂解，表明N端的第42位氨基酸位点对VP5的自动裂解起到了关键性作用。本研究对病毒的体外组装和入侵机制的探究以及VP5和VP7的结构与功能的解析奠定了坚实的基础。