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柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是鸡的一种重要的寄生虫,可引起鸡只严重的肠道病变和死亡,使养鸡业遭受重大损失。柔嫩艾美耳球虫主要的致病阶段在虫体对宿主细胞的入侵,该过程涉及到多种与入侵相关的因子。本研究以柔嫩艾美耳球虫为研究对象,进行了柔嫩艾美耳球虫A08蛋白(EtA08)和棒状体蛋白(EtRP)的单克隆抗体(Monoclonal antibody, McAb)制备,并构建了EtA08的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统,以期为深入探索这些入侵相关因子的作用机理,开发新的控制鸡球虫病的方法提供有价值的实验依据。1. EtA08和EtRP单克隆抗体的制备与鉴定利用原核表达的EtA08和EtRP的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后取脾脏制备免疫脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经间接ELISA和Western blot筛选获得2株抗EtA08蛋白的特异性杂交瘤细胞株,分别命名为1G7和4F11;获得1株抗EtRP的特异性杂交瘤细胞株,命名为2E3。染色体分析表明,3株杂交瘤细胞的染色体数目都在94～108之间。亚类鉴定显示,McAb 1G7和2E3亚类为IgG2a,4F11亚类为IgM。效价测定显示,1G7、4F11、2E3细胞上清效价分别为1:1.6×10~5、1:64、1:40,小鼠腹水效价分别为1:1×10~6、1:1.02×10~5、1:2.56×10~4。同时,试验利用McAb 2E3对EtRP在E. tenella子孢子中的分布进行分子定位,结果显示该蛋白主要分布于子孢子的顶端;而当子孢子在DMEM培养基中41℃孵育1 h后,该蛋白则分布于整个虫体。入侵抑制试验显示,McAb 2E3对子孢子入侵体外培养的DF-1细胞的抑制率达63.5%,说明EtRP在虫体入侵宿主细胞过程中起重要作用。2. EtA08基因毕赤酵母表达系统的构建根据文献设计一对特异性引物,以A08蛋白cDNA为模板扩增出1 083 bp的目的基因片段,将该基因连接到pGEM-T-easy载体上,序列测定和双酶切鉴定表明A08基因克隆成功。用EcoR I和Not I酶切回收目的片段连接至用同样酶切的真核表达载体pPIC9k上,构建了重组质粒pPIC9k-A08,转化大肠杆菌TOP10后,提取质粒,经酶切鉴定正确后用Sac I将重组质粒线性化,再电转入毕赤酵母GS115菌株,G418筛选抗性重组子,经PCR鉴定正确重组子后做甲醇诱导表达。重组酵母诱导表达产物经SDS-PAGE检测证实,E. tenella A08基因在毕赤酵母中成功表达。Western-blot初步分析表明,表达产物具有免疫学反应活性。本试验的上述成果,为进一步研究E. tenella A08蛋白和棒状体蛋白EtRP的生物学功能奠定了良好的基础,对筛选鸡球虫基因工程疫苗和抗球虫药物靶标分子具有重要参考价值。