草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为我国淡水鱼类养殖的主要品种之一，2012年全国渔业统计年鉴显示，我国淡水鱼类养殖产量为2334.11万吨，其中草鱼的养殖产量达478.17万吨，为我国所有养殖鱼类之首。而草鱼出血病的频繁爆发给我国草鱼养殖业造成了巨大经济损失，严重危害我国淡水养殖业的健康发展。草鱼呼肠孤病毒(grasscarp reovirus,GCRV)是致使草鱼出血病爆发的主要病原，是中国大陆分离的第一株鱼类病毒，也是目前毒力最强的水生呼肠孤病毒之一。GCRV的基因组为分11个节段的dsRNA，变异性较强，目前已有40多株分离株得到鉴定。根据VP6基因序列比较，GCRV分离株至少存在3种基因型，代表株分别为Ⅰ型GCRV873、Ⅱ型GCRV HZ08和Ⅲ型GCRV104(HGDRV)，但不同基因型毒株在同等条件下形态、基因组带型、致细胞病变、同种细胞和鱼体中增殖情况等生物学特性未见系统的比较和分析。本研究根据VP4编码蛋白的基因序列对目前已有的毒株构建系统进化树进行分子分型，并结合本实验室保存的毒株进行基因组带型分析，筛选了来自三个不同基因型的GCRV。根据不同基因型毒株S6节段保守序列建立了TaqMan Real-Time PCR方法，量化比较了三株不同基因型GCRV同等条件下在细胞和鱼体中增殖情况及不同理化条件下稳定性以及冻融对其毒力的影响，预期为草鱼出血病的流行病学调查、疾病防控和疫苗制备奠定基础。本研究主要包括以下内容：1、本研究对GenBank中所有提交的GCRV编码外衣壳蛋白基因序列(S6节段)构建系统进化树，GCRV分成三个不同的进化分支。将本实验室保存的部分GCRV进行SDS-PAGE，分析已有毒株的基因组带型。综合系统进化树和基因型带型分析结果，筛选出用于本研究的三个不同基因型的毒株，分别为GCRV JX-0901(Ⅰ型)，GCRVHZ08(Ⅱ型)和GCRV104(Ⅲ型)。采用GCRV编码主要结构蛋白基因序列并结合病毒基因组带型进行病毒分型，进一步优化了GCRV的分型方法。2、为了分析不同基因型GCRV生物学特性差异，本研究根据不同基因型的S6节段保守序列，建立了针对三种基因型GCRV的TaqMan Real-Time PCR检测方法，病毒核酸最低检出量分别为4个拷贝、10个拷贝和8个拷贝，灵敏度均较高。仅能检测出同种基因型相应的目的毒株核酸，对其它病原核酸均没有特异性扩增。3、病毒稳定性分析显示，pH在3.0-10.0范围内，病毒滴度变化不大，且GCRVHZ08的适应pH值范围较GCRV JX-0901株和GCRV104略广，这可能是导致该病毒在水域中广泛存在和在草鱼养殖过程中持续流行的因素之一，这也可能是目前流行病学调查Ⅱ型为主要流行株的原因之一。反复冻融对病毒活性影响较大。三株毒株对乙醚和胰蛋白酶处理均不敏感。4、运用已建立的TaqMan Real-Time PCR方法，研究这三株病毒在细胞和鱼体中的增殖能力。结果显示，GCRV JX-0901株和GCRV104株病毒接种GSB两种形态细胞均出现明显的细胞病变，而GCRV HZ08株病毒在GSB细胞中均无明显病变。GCRV JX-0901株和GCRV104株病毒在GSB-F和GSB-E中的增殖量均显著高于GCRV HZ08株；JX-0901株与GCRV104株无显著性差异。三株毒株同拷贝数等剂量腹腔注射方式感染稀有鮈鲫，连续观察14日，实验鱼未出现发病死亡。病毒检测结果显示，三株病毒在稀有鮈鲫中均以低拷贝增殖。将三株病毒分别连续10倍稀释5个梯度，腹腔注射稀有鮈鲫，注射14日后，采用基因II型的GCRV强毒株进行攻毒，结果显示，不同基因型毒株交叉保护率较低，同基因型间保护率较高。本研究结合GCRV基因组序列分析和基因组带型分析，优化了病毒分型方法，进一步验证了GCRV分为三个基因型的观点，并针对不同基因型的GCRV建立了TaqMan Real-Time PCR方法。首次在同等条件下，量化比较了不同基因型GCRV的生物学特性，为病毒的流行病学调查、病毒特性的深入研究和区域实用性疫苗以及多价疫苗研制奠定基础。