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衰老是叶片发育的最后一个阶段,叶片衰老过程中大分子物质降解与营养元素回收同时进行,最终导致叶片死亡。叶片衰老的启动以及进程均会影响同化产物积累以及营养转运效率,进而影响作物的收成,包括生物量和籽实产量。因此,叶片衰老是作物的一个重要农艺性状。 高粱(Sorghum bicolor)是一种世界性的多用途作物,是粮食、饲料以及生物能源的重要来源。高粱还具有优良的生物学特性,如较强的抗旱性、耐盐碱性、耐涝性以及耐寒性等。目前对高粱叶片衰老方面的研究局限于传统的遗传学研究。尽管已经定位了多个持绿(Stay-green)性状遗传位点,仅有四个主效数量性状遗传位点(QTLs),尚未见到大规模鉴定参与叶片衰老的基因的报道。 本研究按照叶片黄化比率将高粱叶片的发育衰老过程分为四个阶段:成熟期、衰老早期、衰老中期以及衰老晚期。这四个时期的叶片黄化比率分别为0、<10%、10-25%以及>50%。利用转录组测序(RNA-seq)技术对叶片发育衰老四个阶段、黑暗诱导(黑暗处理前和处理后6天)以及盐诱导的两个衰老阶段(盐处理前和处理后5天)的转录组进行测序,并对衰老相关基因进行了全面细致的生物信息学分析。通过对叶片发育衰老四个阶段进行两两比较发现4293个显著性差异表达基因。其中,2351个基因只出现显著性上调,897个基因只出现显著性下调,1045个基因既出现显著性上调又出现显著性下调。本研究将2351个只出现表达上调的基因以及1045个既出现表达上调又出现表达下调的基因称为衰老相关基因,共计3396个。这些衰老相关基因主要富集在代谢过程和催化活性等GO类别以及13个KEGG代谢途径,主要为次生代谢中的合成途径。染色体密度分布结果显示,这些衰老相关基因在1号、4号、5号及7号染色体上的7个区域内(每个区域大小为500Kb)有富集现象,这些区域可能是衰老相关基因的“热点”区域。这些“热点”区域倾向于包含串联重复的基因或者超家族的旁系同源基因。同时,对衰老相关基因的表达模式进行聚类分析获得48个簇。第2、8、25和26簇衰老相关基因富集在叶绿体相关过程中;第1、6和41簇富集在胁迫和刺激响应过程中;第5、13和22簇富集在转移酶活性。另外,通过分析衰老相关基因中的转录因子,发现衰老相关基因在NAC、ERF、WRKY以及CO-like转录因子家族中具有显著性富集。比较发育衰老、黑暗诱导衰老及盐诱导衰老的衰老相关基因,发现有507个衰老相关基因是三者共有的,将它们称为“核心衰老相关基因”。这些基因主要富集在刺激响应过程、氧化还原过程、氮组分降解代谢过程以及转移酶活性等类别,与衰老过程中细胞内环境发生剧烈变化相符合。发育衰老、黑暗诱导衰老和盐诱导衰老特有的衰老相关基因分别为1996个、359个和322个。根据衰老相关基因表达上调的时期筛选了各个阶段的衰老标记基因,并分别与核心衰老相关基因以及各时期特有的衰老相关基因进行比较,筛选了176个衰老相关基因作为各时期候选标记基因。最后,根据3396个衰老相关基因中单核苷酸多态性(SNP)以及插入缺失(Indel)在高粱基因组SNP数据库(SorGSD)中的48个品种中的的分布情况,推测衰老相关基因在一定程度上是相对保守的。 综上所述,本研究首次利用RNA-seq技术对高粱叶片衰老转录组进行分析,鉴定出高粱衰老相关基因并按照基因的不同表达模式进行聚类分析,同时分析了衰老相关基因在染色体上的分布以及转录因子家族在聚类分析得到的48个簇中的分布情况。此外,筛选了衰老标记基因,为高粱衰老表型研究以及高产育种提供了重要的基因资源。