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生殖质是在许多物种卵子发生中形成的一种特殊细胞质成分,含有这种成分的细胞才能发育为生殖细胞。对果蝇研究表明,magonashi基因是生殖质组装和形成的一个关键基因,其编码的蛋白质能识别并结合某些生殖质决定基因的RNA,形成复合体,穿过核膜进入核质区域,指导生殖质的正确组装形成。从低等的真核生物酵母到高等的哺乳动物人,都存在magonashi的同源基因并且相似性非常高。
为进一步阐明家蚕生殖发育的调控机制,在家蚕基因组、EST数据以及芯片数据分析的基础上,本论文对果蝇中已报道的生殖质决定相关基因在家蚕中的同源基因进行了鉴定,并对其表达模式进行了分析,然后对高度保守的magonashi基因进行了克隆和原核表达,以期为以后深入了解该基因的功能研究奠定基础,获得结果如下:
1.果蝇生殖质决定相关基因在家蚕中的同源基因分析从FlyBase下载果蝇生殖质形成相关基因18个(aubergine,spire,nanos,torso,tudor,vasa,pumilio,par-1,cappuccino,staufen,oskar,valois,germ-cellless,polar-granulecomponent,mtlrRNA,magonashi,tsunagi,exuperantia),通过与家蚕基因组数据进行BLAST比对分析,发现除oskar,valois,germ-cellless,polargranulecomponent,mtlrRNA5个基因外,其余13个基因在家蚕中均有同源基因,并根据基因芯片数据分析了预测的家蚕生殖质形成相关基因的表达模式。发现在这些同源的生殖质形成相关基因中,有5个基因(Bmcapu,Bmnos,Bmvas,Bmaub,Bmexu)在雌雄发育后期有显著差异表达;有4个基因(Bmtud,Bmmago,Bmtsu,Bmstau)在雌雄发育过程中无差异表达;有3个基因(Bmnos,Bmvas,Bmaub)在生殖腺中特异表达;有6个基因(Bmcapu,Bmmago,Bmtsu,Bmexu,Bmstau,Bmtud)除在生殖腺中表达外,还在其它组织有高表达。
2.家蚕magonashi基因的克隆及mRNA表达检测根据预测序列设计引物,进行RT-PCR扩增和克隆测序验证,成功地克隆到家蚕magonashi基因完整的编码区序列。分析发现该基因位于nscaf2655上,只有一个完整的拷贝,在基因组上有1611bp,共有两个外显子,分别为258bp和183bp,并且外显子、内含子边界符合典型的GT-AG结构。克隆的magonashi基因完整的编码区序列为441bp,编码146个氨基酸残基。RT-PCR检测了该基因在发育各时期各组织器官的表达情况,发现该基因在所检测的所有发育时期、组织器官均有表达,是一个非特异表达基因。
3.家蚕magonashi基因的原核表达将家蚕magonashi基因的编码区序列克隆到原核表达载体pET28-a中,并将构建成的pET-magonashi重组质粒转化表达宿主菌EscherichiacoliBL21(DE3)细胞,IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测分析。结果表明,同对照相比,重组质粒在23.5KD处有一条十分明显的新增蛋白带,与预测的蛋白质大小一致,说明该基因体外重组表达成功。进一步的分析发现该重组蛋白主要以包涵体的形式存在。