HAb18G/CD147与integrinβ1亚基相互作用调节肝癌细胞恶性行为及放疗抵抗的机制

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肝癌是严重影响人类健康的疾病,其致死率在所有癌症中排在第三位。全球每年新诊断患者有一半在中国,特别是在沿海地区,肝癌的发病率和致死率正逐年攀升。然而由于肝癌发病多隐匿,早期诊断率低,发展快、易转移,一旦出现临床症状,常已处于中晚期。同时由于肝癌的高转移和复发率,直接影响患者的生存及预后。因此,深入研究肝癌的侵袭转移调节机制,对提高肝癌治疗效果有所提示,并能为进一步发展新型辅助治疗方式提供理论支持。HAb18G/CD147作为一种跨膜糖蛋白,广泛存在于各种肿瘤细胞表面,在肝癌组织中高表达。本科室的研究提示,HAb18G/CD147通过刺激肝癌细胞及间质成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)促进肝癌浸润、转移。整合素(integrin)作为细胞介导肿瘤细胞相互作用及传递胞内外信号的重要细胞粘附分子,在肿瘤细胞侵袭、转移、存活中发挥作用。HAb18G/CD147通过与integrin结合,增强肝癌细胞的恶性行为,促进肝癌的进展。然而,CD147与integrin的作用位点及调节机制仍有待进一步研究。越来越多的研究提示,integrin是重要的肝癌预后相关分子;integrin信号及下游通路FAK-PI3K活化在多种恶性肿瘤的放射抵抗中发挥重要作用。而integrin下游PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活可抑制癌细胞凋亡,使其逃逸放射治疗的杀伤作用,这是放射抵抗现象的重要机制之一。但是CD147与integrin相互作用在肝癌放射抵抗中的作用机制仍然不甚明确。本研究旨在阐明CD147与integrinβ1的结合方式、作用位点和调节机制,以及二者的相互作用在肝癌细胞恶性行为调节及放射抵抗中的作用。因此,本课题共包括四个部分:第一部分:HAb18G/CD147通过胞外近膜端I-like结构域与integrinβ1亚基二价阳离子结合位点(MIDAS)相互作用。研究表明,肝癌重要抗原HAb18G/CD147分子与integrinα3β1、α6β1之间存在着相互作用。通过哺乳动物蛋白与蛋白相互作用系统(mammalian protein–proteininteraction Trap,MAPPIT),我们发现HAb18G/CD147通过胞外近膜端I型结构域而非C2结构域与integrinβ1亚基相互作用。分别点突变HAb18G/CD147I-like结构域第136位、144位、147位、179位、194位天冬氨酸残基,MAPPIT系统结果显示第179位天冬氨酸残基突变后,HAb18G/CD147与integrinβ1的共沉淀减弱。点突变integrinβ1亚基胞外头部结构的βA结构域中MIDAS位点,MAPPIT系统结果显示突变可降低HAb18G/CD147与integrinβ1的相互作用。以上结果显示,HAb18G/CD147胞外近膜结构域I-like结构域与integrinβ1亚基胞外头部结构的βA结构域中MIDAS位点存在相互作用,I-like结构域第179位天冬氨酸残基在结合中发挥重要作用。第二部分:MIDAS位点的结合短肽GRGDS和二价阳离子竞争性调节HAb18G/CD147与integrinβ1的相互作用HAb18G/CD147与经典的含有RGD序列的纤维连接蛋白(fibronectin)都通过MIDAS位点实现与integrinβ1亚基的结合。MAPPIT结果显示,fibronectin可通过作用于MIDAS位点竞争性抑制HAb18G/CD147与integrinβ1亚基的相互作用。免疫共沉淀和免疫荧光共聚焦实验发现,GRGDS短肽可以竞争性抑制SMMC-7721肝癌细胞中HAb18G/CD147与integrinβ1的共沉淀,并减少二者在肝癌细胞膜上的共定位。酶联免疫反应实验结果显示,作用于integrinβ1MIDAS位点的Mn2+、Mg2+离子,可促进HAb18G/CD147分子与integrinβ1亚基之间相互作用。以上结果显示,肝癌细胞中对MIDAS位点的调节可影响HAb18G/CD147与integrinβ1亚基间的相互作用。第三部分:HAb18G/CD147通过与integrinβ1亚基相互作用促进肝癌细胞恶性行为。Integrin属于异源二聚跨膜蛋白,在细胞内外双向信号传递中发挥重要作用,其信号传导机制包括由胞外传至胞内的inside-out方式及胞内传至胞外的outside-in方式。采用shRNA干涉技术建立HAb18G/CD147稳定干涉的SMMC-7721肝癌细胞系,western-blot实验显示在HAb18G/CD147稳定干涉的SMMC-7721细胞中,integrinβ1outside-in信号传导通路下游粘着斑激酶FAK表达水平、FAK磷酸化及Akt磷酸化水平均明显下调,integrinβ1表达无显著变化;加入GRGDS短肽孵育,western-blot实验结果显示FAK-PI3K/Akt通路活性亦显著降低。HAb18G/CD147干涉还引起胞内的calpain-talin信号失活,通过integrinβ1inside-out通路调节integrin胞外区的结合能力,流式细胞术结果显示活化的integrinβ1比例上调,从而进一步增强integrinoutside-in信号传导通路。细胞免疫荧光共聚焦实验证实,干涉HAb18G/CD147表达或加入GRGDS短肽孵育均引起肝癌细胞骨架重排。体外划痕实验显示干涉HAb18G/CD147表达或加入GRGDS短肽孵育的肝癌细胞迁移能力明显下降;体外侵袭实验、软琼脂克隆形成实验及明胶酶谱实验显示,肝癌细胞的侵袭能力、克隆形成及基质金属蛋白酶分泌能力均显著减弱。裸鼠皮下成瘤及原位肝转移模型显示,HAb18G/CD147稳定干涉的肝癌细胞皮下成瘤能力及转移能力均显著降低;瘤内或腹腔GRGDS短肽注射也引起了相似结果。裸鼠皮下成瘤及转移模型显示,HAb18G/CD147与integrin β1亚基相互作用受到抑制后,肝癌细胞皮下成瘤能力及转移能力均显著降低。以上结果表明,在肝癌细胞中,HAb18G/CD147与integrinβ1亚基在细胞膜表面相互作用,进而激活integrinβ1out-inside信号通路,活化其下游FAK信号及PI3K/Akt信号,并通过胞内的calpain-talin激活integrinβ1inside-out信号通路,使outside-in信号进一步增强;从而调节肝癌细胞的骨架重排,并影响侵袭能力、克隆形成能力、体内成瘤能力和转移能力。第四部分:HAb18G/CD147通过与integrinβ1亚基相互作用促进肝癌细胞放射抵抗。随着放射设备和技术的进步,放射治疗对肝癌的临床疗效得到明显提高,但肝癌细胞中放射抵抗现象的存在仍是制约放疗效果的重要因素。有报道认为,integrin下游的PI3K/Akt通路的激活在细胞放射抵抗中意义重大。我们将肝癌细胞和肝细胞系分别进行X线照射,克隆形成实验显示,在正常肝细胞系QZG和肝癌细胞系Huh7、SMMC-7721中,HAb18G/CD147表达最高的SMMC-7721细胞放射敏感性最低。低剂量X-ray照射三种细胞后,Annexin V/PI凋亡实验显示,SMMC-7721细胞放射后早期凋亡细胞比例与未照射组相比并无明显变化;而Huh7和QZG细胞照射后早期凋亡细胞比例明显上升。Western-blot实验显示,低剂量X-ray照射上调了SMMC-7721细胞中CD147表达,并引起血管发生及侵袭相关分子上调,包括VEGF、EGF和MMPs。同时HAb18G/CD147介导的侵袭、迁移能力增强。采用锌指核酸酶(zinc-fingernucleases,ZFN)技术构建HAb18G/CD147敲除的K7721细胞系,并进行低剂量X-ray照射,发现放射后凋亡细胞比例显著增加,克隆形成能力下降,细胞周期中S-phase比例降低。将7721和K7721细胞接种至裸鼠皮下成瘤,并进行低剂量放射治疗,发现CD147敲除后的肝癌细胞系放射敏感性增高,皮下瘤体积及重量均显著降低。肝癌细胞原位转移实验显示,CD147敲除后的肝癌细胞系经低剂量放射后形成的原位癌灶体积缩小,转移灶数目减少。通过对通路的研究,我们发现CD147与integrinβ1结合后,通过outside-in信号通路激活FAK-PI3K/Akt信号,并引起p53低表达,共同参与肝癌细胞的放射抵抗。以上结果显示,在肝癌细胞中HAb18G/CD147与integrinβ1的相互作用可降低肝癌细胞的放射敏感性,增强肝癌细胞的放射抵抗;同时CD147与integrinβ1的相互作用还可增强放射抵抗的肝癌细胞放射后侵袭迁移能力。综上所述,本研究发现肝癌细胞膜蛋白HAb18G/CD147通过其胞外近膜端I-like结构域与integrinβ1亚基胞外头部MIDAS位点结合,结合能力受与MIDAS位点结合的含RGD短肽的配体调节。HAb18G/CD147与integrinβ1的相互作用可激活integrin下游FAK-PI3K/AKT通路,引起肝癌细胞骨架重排,增强肝癌细胞恶性行为。HAb18G/CD147可通过与integrinβ1的相互作用激活integrin下游双向信号通路,从而降低肝癌细胞的放射敏感性,增强肝癌细胞放射后侵袭迁移能力。上述研究阐明了CD147和integrinβ1的相互作用在肝癌恶性行为和放射抵抗现象中发挥的重要作用,有助于进一步了解肝癌相关分子网络,并为探索提高肝癌治疗效果提供一定的理论依据。
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