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目的：筛选得到产油含量较高的耶氏解脂酵母菌,在氮限制培养基中发酵培养,检测分析发酵过程中生化特征的变化,初步探讨耶氏解脂酵母油脂积累的机制。
方法：利用相同氮限制培养基筛选油脂产量高的耶氏解脂酵母菌株,测定不同碳源和氮源对油脂产量和生物量的影响;在氮限制培养基中发酵培养,监测发酵过程中培养基碳源和氮源的变化,并检测酵母菌生物量、油脂含量及脂肪酸组成,同时用高效液相色谱法测定分泌到细胞外柠檬酸和异柠檬酸的含量。同时用分光光度法测定细胞内苹果酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、NADP依赖型异柠檬酸脱氢酶、AMP脱氨酶、NAD依赖型异柠檬酸脱氢酶、ATP柠檬酸裂酶的活性。
根据NCBI公布的耶氏解脂酵母苹果酸酶基因设计带有BamH I酶切位点的一对引物mae-F和mae-R,以基因组为模板扩增基因全长,连入T载体,然后用限制性内切酶BamH I同时酶切pMT-mae和空载体pET28a(+),回收所需片段用T4 DNA连接酶连接,构建苹果酸酶原核表达载体pET28a-mae。将构建完成的表达载体pET28a-mae转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组苹果酸酶表达,初步优化表达条件,Ni-NTA亲和层析柱纯化苹果酸酶重组蛋白质,测定重组苹果酸酶对辅酶NAD和NADP的Km值。
结果：初步筛选得到含脂量较高的Yarrowia lipolytica DSMZ1345,并选定甘油作为发酵培养的碳源,酒石酸铵和酵母提取物作为发酵培养的氮源。Yarrowia,lipolytica DSMZ1345在氮限制培养基中发酵培养,氮源在7-8小时左右耗尽,此时生物量增加减缓而趋于稳定,而油脂在氮源耗尽开始积累,最高可达到细胞干重的18.1％,而其脂肪酸组成基本没有变化。发酵过程中,酵母细胞将大量柠檬酸和异柠檬酸转运出细胞外,最终培养基中柠檬酸和异柠檬酸浓度达到51.79g/l和14.3g/l。N源耗尽时,AMP脱氨酶活性增加而NAD依赖型异柠檬酸脱氢酶活性降低,这可能是酵母细胞油脂积累的开始。细胞内生成NADPH的三种酶苹果酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、NADP依赖型异柠檬酸脱氢酶的活性变化并没有和油脂积累相关联。ATP柠檬酸裂酶活性变化与油脂积累变化趋势一致,可能是耶氏解脂酵母油脂积累的关键酶。
为了进一步验证苹果酸酶在该酵母中的作用,我们构建了耶氏解脂酵母苹果酸酶表达载体pET28a-mae,BamH I和Sal I分别单酶切条带正确,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,诱导条件为温度20℃,IPTG浓度0.2 mM,诱导时间5 h,得到大量可溶性蛋白质,经过Ni-NTA层析柱纯化得到重组苹果酸酶,在一定反应体系中测得重组苹果酸酶对NAD的Km为1.57 mM,Vmax为714.29nmol/min*mg,而重组苹果酸酶虽能利用NADB但其对NADP的亲和力很低,无法计算Km值。
结论：耶氏解脂酵母能较好的利用甘油作为碳源积累生物量和油脂;耶氏解脂酵母在氮限制培养基发酵培养时直接进入指数生长期,培养基中氮耗尽后酵母细胞能迅速积累油脂,但油脂的积累量不高,而细胞能将大量柠檬酸转运出细胞外;ATP柠檬酸裂酶与油脂积累趋势一致,可能是耶氏解脂酵母油脂积累的关键酶;成功构建耶氏解脂酵母苹果酸酶基因原核表达质粒pET28a-mae,并获得高效表达重组苹果酸酶的宿主菌BL21;重组苹果酸酶在特定酶反应体系下,对NAD的亲和力较高,Km值为1.57 mM,Vmax为714.29nmol/min*mg,而重组酶对NADP的亲和力较低,可能不是耶氏解脂酵母油脂积累的关键酶。