第一部分脊髓源性神经干细胞的分离培养、增殖和自然分化 目的：探讨从大鼠胚胎脊髓组织中分离培养的脊髓源性神经干细胞在克隆增殖和自然分化方面的生物学特点。 方法：采用无血清培养技术将孕龄13d的胚胎大鼠脊髓组织制备成单细胞悬液，接种到含有表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)的DMEM/F12(1∶1)加B27(B27supplement)的无血清培养液中培养，待形成原代克隆球后传代扩增。将一部分神经球用神经上皮干细胞蛋白(neuroepithelialstemproteins，Nestin)免疫荧光检测。另一部分神经球用1％胎牛血清的培养液诱导分化，14d后分别进行神经元和星形胶质细胞特异性标记物微管相关蛋白-2(microtubuleassociatedproteins-2，MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)的免疫荧光检测。 结果：脊髓细胞悬液培养2周后可形成由数百个细胞组成的呈悬浮生长的神经球，神经球经Nestin免疫荧光检测呈阳性。神经干细胞经诱导后自然分化2周后MAP2阳性和GFAP阳性的细胞均有生成。 结论：从大鼠胚胎脊髓组织中分离得到的细胞具有不断增殖和自我更新能力，并具有分化为神经元、星形胶质细胞的多分化潜能，是中枢神经系统的干细胞。 第二部分体外脊髓源性神经干细胞向胆碱能神经元的定向分化 目的：探讨体外脊髓源性神经干细胞定向诱导分化为胆碱能神经元的方法。 方法：取5块6孔培养板接种脊髓源性神经干细胞克隆球，分为五组(包括对照组)，每组一板，加入不同的诱导分化培养液，对照组仅为诱导培养基的基本成分。在饱和湿度的37℃、5％CO2培养箱中分化14d后，用免疫荧光检测各组细胞中胆碱能神经元特异性标志物胆碱乙酰转移酶(cholineacetyltransferaseChAT)的表达，每个样本随机挑选15个视野进行计数，待计数完后最后进行合计。 结果以ChAT阳性细胞数与由Hoechst33342标记的细胞核数(代表总细胞数)的比率表示。统计分析结果由SPSS软件得出结论。结果：在SHH和RA的共同诱导下，ChAT阳性细胞数约占总细胞数的21％；在SHH和NT-3的共同诱导下，ChAT阳性的细胞数约占总细胞数的20％；在RA或SHH的单一诱导作用下，仅能发现少量ChAT阳性的细胞；在对照组中未发现ChAT阳性的细胞。 结论：SHH和RA与SHH和NT-3的共诱导都可以诱导脊髓源性神经干细胞能在体外分化为胆碱能神经元。 第三部分骨髓基质细胞对共培养条件下的脊髓源性神经干细胞分化为胆碱能神经元的影响 目的：通过与骨髓基质细胞进行共培养，观察脊髓源性神经干细胞向胆碱能神经元分化的情况。 方法：通过细胞培养法获取骨髓基质细胞(BMSCs)，用TranswellPermeableSupports来构建共培养体系。共培养的培养基为含B27和bFGF的DMEM/F12培养液。对照组不与BMSCs共培养，培养基与共培养的培养基相同。14d后进行细胞免疫荧光染色观测ChAT的表达。随机挑选15个视野进行计数，最后进行合计。 结果以ChAT阳性细胞数与由Hoechst33342标记的细胞核数(代表总细胞数)的比率表示。用SPSS软件分析结果。结果：共培养体系中分化的脊髓源性神经干细胞有20％表现为ChAT阳性。对照组中未发现ChAT阳性的细胞。 结论：脊髓源性神经干细胞与骨髓基质细胞共培养时，可以被诱导分化为胆碱能神经元。