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丁醇作为大宗化学品，广泛应用于化工、医药、能源等领域。随着化石能源日益枯竭以及全球环境问题的不断恶化，丁醇由于其理化性质优于乙醇并且与汽油相似，因此，被认为是比乙醇更好的第二代生物燃料。丁醇可通过石油化工合成法和微生物发酵法生产，石油化工法合成丁醇具有高效性和经济性，目前仍是生产丁醇的主要方法。但由于化石能源的不可再生性以及石化工业会对环境造成严重污染等问题，因此，具有可持续发展和环境友好型等优点的微生物发酵法生产丁醇重新受到人们的关注，并成为全球科学家研究的热点。但微生物发酵法生产丁醇面临着产量低、生产效率低以及生产成本高等诸多问题和挑战，导致其市场竞争力远低于石油化工法。因此，进一步提高丁醇产量和生产效率、降低生产成本是提高生物丁醇市场竞争力的关键。本论文通过基冈工程手段对丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)进行改造，以提高丁醇生产强度和对木质纤维素生物质的利用能力。
在C．acetobutylicumATCC824中过表达VBI生物合成相关基冈thiC、thiG和thiE，显著提高菌体VBI的生物合成强度，促进碳源代谢以及能量生产，最终使更多的碳源流向丁醇合成。在不添加VBI的P2培养基中，工程菌C．acetobutylicum824(thiCGE)的碳源利用和丁醇合成得到显著提高。当以葡萄糖为底物时，底物消耗和丁醇产量分别提高了11.6±2.8%和13．O±0.1%；当以木糖为底物时，总碳源消耗和丁醇产量分别提高了11.6±0.4%和12.7±1.2%；当以混合糖为底物时，木糖消耗和丁醇产量分别提高了45.8±1.9%和20.4±0.3%。
辅因子NADH在丁醇的生物合成过程中起关键作用。C．acetobutylicumATCC824胞内NADH的供应不足限制了丁醇合成，因此提高C．acetobutylicumATCC824胞内NADH的供应是提高丁醇合成的有效途径。在ABE发酵过程中外源添加NAD(H)从头合成前体物质一天冬氨酸，发现丁醇产量显著提高，进一步研究表明NAD+从头合成相关基因nadA、nadB和nadC的表达量显著上调，胞内总NAD(H)的浓度显著提高。有鉴于此，在C．acetobutylicumATCC824中研究了过表达NAD+从头合成相关基因对丁醇合成的影响。结果表明，分别过表达nadA、nadB和nadC后，丁醇产量均有提高，其中过表达nadC丁醇产量提高最为显著，较出发菌提高了13.5±0.4%。为了进一步提高丁醇产量，同时过表达了VBI生物合成相关基因thiC、thiG、thiE和DNA(H)从头合成相关基因nadC，使得在提高碳源代谢和能量生产的同时强化NADH的供应。结果表明，工程菌C．acetobutylicum824(thiCGE-nadC)的丁醇产量达到13.96±0.11g/L，较工程菌C．acetobutylicum824(thiCGE)和C．acetobutylicum824(nadC)分别提高了7.2±0.4%和18.1±0.1%，较出发菌提高了34.1±0.1%。
研究了嗜极微生物热激蛋白对C．acetobutylicumATCC824细胞性能的影响。在C．acetobutylicum824中异源表达来自耐辐射奇异球菌DeinococcuswulumuqiensisR12的热激蛋白GroESL和DnaK，显著提高菌体对丁醇、低pH值以及纤维素水解液抑制物的耐受性，同时也发现来自于DeinococcuswulumuqiensisR12的热激蛋白性能优于C．acetobutylicum824本身的热激蛋白，异源表达来自DeinococcuswulumuqiensisR12的热激蛋白DnaK的工程菌C．acetobutylicum824(dnaK R12)性能最佳。当以未脱毒的大豆秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆水解液为底物发酵时，工程菌C．acetobutylicum824(dnaK R12)的丁醇产量分别达到5.82±0.07、3.32±0.15和4.38±0.30g/L，较出发菌(4.50±0.14g/L、1.63±0.21g/L和2.03±0.03g/L)分别提高了29.4±2.5%、104.8±17.1%和115.7±lO.g%。
探索了脯氨酸对C．acetobutylicumATCC824耐受纤维素水解液抑制物的影响。通过外源添加脯氨酸后，菌体对甲酸、阿魏酸、丁香醛和香豆酸的耐受性显著提高。进一步研究表明，共表达脯氨酸合成相关基因proA、proB和proC后，胞内脯氨酸合成能力和ROS清除能力得到显著提高，同时，T程菌C．acetobutylicum824(proABC)对甲酸、阿魏酸、丁香醛和香豆酸的耐受性也显著提高。当以未脱毒的大豆秸秆、水稻秸秆和玉米秸秆水解液为底物发酵时，工程菌C．acetobutylicum824(proABC)的丁醇产量分别为8.0±0.07、7.80±0.20和6.30±0.10g/L，分别是出发菌的2、3.4和4.4倍。
上述研究结果表明，本研究所使用的策略成功提高了C．acetobutylicumATCC824的丁醇生产能力和对木质纤维素生物质的利用能力，对其它燃料微生物的相关分子育种具有一定的参考价值。
在C．acetobutylicumATCC824中过表达VBI生物合成相关基冈thiC、thiG和thiE，显著提高菌体VBI的生物合成强度，促进碳源代谢以及能量生产，最终使更多的碳源流向丁醇合成。在不添加VBI的P2培养基中，工程菌C．acetobutylicum824(thiCGE)的碳源利用和丁醇合成得到显著提高。当以葡萄糖为底物时，底物消耗和丁醇产量分别提高了11.6±2.8%和13．O±0.1%；当以木糖为底物时，总碳源消耗和丁醇产量分别提高了11.6±0.4%和12.7±1.2%；当以混合糖为底物时，木糖消耗和丁醇产量分别提高了45.8±1.9%和20.4±0.3%。
辅因子NADH在丁醇的生物合成过程中起关键作用。C．acetobutylicumATCC824胞内NADH的供应不足限制了丁醇合成，因此提高C．acetobutylicumATCC824胞内NADH的供应是提高丁醇合成的有效途径。在ABE发酵过程中外源添加NAD(H)从头合成前体物质一天冬氨酸，发现丁醇产量显著提高，进一步研究表明NAD+从头合成相关基因nadA、nadB和nadC的表达量显著上调，胞内总NAD(H)的浓度显著提高。有鉴于此，在C．acetobutylicumATCC824中研究了过表达NAD+从头合成相关基因对丁醇合成的影响。结果表明，分别过表达nadA、nadB和nadC后，丁醇产量均有提高，其中过表达nadC丁醇产量提高最为显著，较出发菌提高了13.5±0.4%。为了进一步提高丁醇产量，同时过表达了VBI生物合成相关基因thiC、thiG、thiE和DNA(H)从头合成相关基因nadC，使得在提高碳源代谢和能量生产的同时强化NADH的供应。结果表明，工程菌C．acetobutylicum824(thiCGE-nadC)的丁醇产量达到13.96±0.11g/L，较工程菌C．acetobutylicum824(thiCGE)和C．acetobutylicum824(nadC)分别提高了7.2±0.4%和18.1±0.1%，较出发菌提高了34.1±0.1%。
研究了嗜极微生物热激蛋白对C．acetobutylicumATCC824细胞性能的影响。在C．acetobutylicum824中异源表达来自耐辐射奇异球菌DeinococcuswulumuqiensisR12的热激蛋白GroESL和DnaK，显著提高菌体对丁醇、低pH值以及纤维素水解液抑制物的耐受性，同时也发现来自于DeinococcuswulumuqiensisR12的热激蛋白性能优于C．acetobutylicum824本身的热激蛋白，异源表达来自DeinococcuswulumuqiensisR12的热激蛋白DnaK的工程菌C．acetobutylicum824(dnaK R12)性能最佳。当以未脱毒的大豆秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆水解液为底物发酵时，工程菌C．acetobutylicum824(dnaK R12)的丁醇产量分别达到5.82±0.07、3.32±0.15和4.38±0.30g/L，较出发菌(4.50±0.14g/L、1.63±0.21g/L和2.03±0.03g/L)分别提高了29.4±2.5%、104.8±17.1%和115.7±lO.g%。
探索了脯氨酸对C．acetobutylicumATCC824耐受纤维素水解液抑制物的影响。通过外源添加脯氨酸后，菌体对甲酸、阿魏酸、丁香醛和香豆酸的耐受性显著提高。进一步研究表明，共表达脯氨酸合成相关基因proA、proB和proC后，胞内脯氨酸合成能力和ROS清除能力得到显著提高，同时，T程菌C．acetobutylicum824(proABC)对甲酸、阿魏酸、丁香醛和香豆酸的耐受性也显著提高。当以未脱毒的大豆秸秆、水稻秸秆和玉米秸秆水解液为底物发酵时，工程菌C．acetobutylicum824(proABC)的丁醇产量分别为8.0±0.07、7.80±0.20和6.30±0.10g/L，分别是出发菌的2、3.4和4.4倍。
上述研究结果表明，本研究所使用的策略成功提高了C．acetobutylicumATCC824的丁醇生产能力和对木质纤维素生物质的利用能力，对其它燃料微生物的相关分子育种具有一定的参考价值。