特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF），是一种严重的肺间质疾病，其发生的主要病理特点是早期的弥漫性肺泡炎，后期大量成纤维细胞病理性增殖转型及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)进行性异常积聚并取代正常的肺组织结构，实质是肺泡损伤，肺组织过度修复，异常重塑的过程。其发病原因尚不明确，病原微生物、粉尘、药物、化学制剂等多种因素均可诱导产生肺纤维化，目前临床治疗干预方法效果差，5年生存率仅有30％-50％。近年来国际研究认为肺间质干细胞参与IPF的发生发展，而其作用的关键点在于肺间质干细胞的双向分化。另外，Wnt/β-catenin信号通路参与了肺纤维化的发生发展，在IPF患者肺组织中发现了Wnt/β-catenin信号通路的过度激活。我们实验室前期研究发现，Wnt/β-catenin信号通路能够调控骨髓间充质干细胞的分化。因此，我们猜测Wnt/β-catenin信号通路参与并调控LR-MSCs的分化。根据以上猜测，本课题探究了调控Wnt/β-catenin信号通路影响肺间质干细胞分化的分子机制，并开展了IPF干预的基础研究。　　全文分为三部分:　　第一部分:调控Wnt/β-catenin信号通路对肺间质干细胞分化影响的研究。　　目的：　　完善小鼠原代肺间质干细胞分离、纯化方法，并对分离纯化，体外培养后的小鼠原代肺间质干细胞进行鉴定。探讨Wnt/β-catenin信号通路对小鼠肺间质干细胞双向分化的调控作用。并引入物理学新方法，对小鼠肺间质干细胞双向分化过程进行，高敏感性的连续监测。　　方法：　　1.采用免疫磁珠分选技术分离纯化小鼠原代肺间质干细胞，并通过流式，免疫荧光检测其干细胞特异性蛋白的表达。　　2.建立小鼠肺间质干细胞与小鼠肺泡二型上皮细胞共培养体系，通过加入Wnt/β-catenin信号通路激活剂Wnt3a(10ng/ml)，抑制剂Dkk-1(20ng/ml)，通过细胞形态学观察、Western blot、免疫荧光等技术确定Wnt/β-catenin信号通路对LR-MSCs向上皮细胞的影响。　　3.采用转录生长因子(TGF)-β(10ng/ml)，Wnt3a(10ng/ml)连续作用LR-MSCs7，14天，通过Western blot免疫荧光技术证明激活Wnt/β-catenin信号通路能够促进LR-MSCs向成纤维细胞分化。　　4.采用星形金纳米颗粒，表面增强拉曼光谱技术，表征LR-MSCs双向分化过程。　　结果：　　1.原代LR-MSCs特异性表达Sca-1、CD44、CD106、CD29、CD90以及ABCG-2，不表达CD45和CD31，符合干细胞特性。　　2.LR-MSCs与ATⅡ细胞共培养能够诱导LR-MSCs向ATⅡ分化，通过细胞形态学观察、Western blot、免疫荧光检测结果显示抑制Wnt/β-catenin信号通路，能够促进LR-MSCs向ATⅡ细胞分化。　　3.TGF-β与Wnt3a连续作用与LR-MSCs后，通过Western blot，免疫荧光检测结果显示，LR-MSCs内成（肌）纤维细胞特异性蛋白表达明显上升，从而证明激活Wnt/β-catenin信号通路可以促进肺间质干细胞向成纤维细胞分化　　4.成功采用星型金纳米探针，表面增强拉曼光谱连续监测LR-MSCs的双向分化过程，证实这种方法能够在不损伤细胞的条件下连续监测细胞分化。　　结论：　　1.成功建立小鼠LR-MSCs原代培养体系。　　2.Wnt/β-catenin信号通路参与LR-MSCs分化，抑制Wnt/β-catenin信号通路能够促进LR-MSCs向肺泡二型上皮细胞分化;激活Wnt/β-catenin信号通路能够促进LR-MSCs向成纤维细胞分化。　　3.采用星形金纳米探针、表面增强拉曼光谱技术表征LR-MSCs分化过程，能够在不损伤细胞的条件下连续监测细胞变化。　　第二部分:肺间质干细胞向成纤维细胞分化过程中关键Wnt蛋白的筛选。　　目的：　　在小鼠肺间质干细胞向成纤维细胞分化过程中，筛选出在特异性高表达的关键Wnt蛋白。并在LR-MSCs向成纤维细胞分化过程中，以及博来霉素诱导小鼠IPF模型中验证关键Wnt蛋白的表达。　　方法：　　1.采用TGF-β(10ng/ml)诱导小鼠肺间质干细胞向成纤维细胞分化，通过Western blot、Real-time PCR、免疫荧光检测LR-MSCs中成（肌）纤维细胞特异性蛋白的表达。　　2.采用Affymetrix Gene Chip Mouse Gene1.0ST Array进行mRNA表达谱分析，检测LR-MSCs向成纤维细胞分化过程中，特异性表达的Wnt蛋白。　　3.采用Western blot、Real-time PCR、免疫荧光、免疫组化检测Wnt8b在LR-MSCs向成纤维细胞分化过程中，以及博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型中的表达。　　结果：　　1.TGF-β诱导LR-MSCs向成纤维细胞分化过程中，我们通过Western blot、Real-time PCR、免疫荧光技术检测成纤维特异性蛋白表达，结果确定LR-MSCs向成纤维细胞的分化起始点为7天。　　2.通过Affymetrix Gene Chip Mouse Gene1.0ST Array芯片分析，在LR-MSCs向成纤维细胞分化过程中，Wnt8b的表达有显著性的上调。　　结论：　　1.筛选得到LR-MSCs向成纤维细胞分化过程中特异性高表达的关键Wnt蛋白，Wnt8b。　　2.在LR-MSCs分化过程以及博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型肺组织中分别证明，Wnt8b的表达都明显升高，与肺纤维化发生密切相关。　　第三部分:特异性阻断Wnt/β-catenin信号通路对特发性肺纤维化的干预研究。　　目的：　　探讨Wnt8b在小鼠肺间质干细胞向成纤维细胞分化，以及博来霉素诱导小鼠肺纤维化过程中调控机制。研究特异性抑制Wnt8b的表达对抑制LR-MSCs向成纤维细胞分化，干预特发性肺纤维化的发生发展的作用，为临床上治疗IPF提供新思路和理论依据。　　方法：　　1.构建调控Wnt8b的shRNA慢病毒以及过表达慢病毒，并验证慢病毒对Wnt8b的调控作用。　　2.在TGF-β诱导肺间质干细胞向成纤维细胞分化过程中，采用shRNA慢病毒调控LR-MSCs内Wnt8b的表达，然后通过Real-time PCR、Western blot、免疫荧光检测β-catenin以及成（肌）纤维细胞特异性蛋白的表达。　　3.采用过表达慢病毒上调LR-MSCs中的Wnt8b，通过Real-time PCR、Western blot、免疫荧光检测β-catenin以及成（肌）纤维细胞特异性蛋白的表达。　　4.小鼠被随机分为四组，48只6-7周龄雄性C57BL/6小鼠，随机分为4组:①阴性对照(NC):气道滴注给予对照空载病毒7天后再给予50μl/只生理盐水;②阴性对照+博来霉素组:通过气道滴注给予对照空载病毒7天后再给予50μl生理盐水溶解博来霉素(5mg/kg);③shRNA慢病毒+博来霉素组:通过气道滴注给予shRNA慢病毒7天后再给予50μ1生理盐水溶解博来霉素(5mg/kg);④过表达慢病毒组:通过气道滴注只给予过表达慢病毒处理。组织病理切片观察肺组织结构，马松染色技术观察肺组织胶原蛋白沉积情况。　　5.通过气道滴注给予慢病毒的方法，调控博来霉素诱导小鼠模型中小鼠肺组织内Wnt8b的表达，通过免疫荧光，胶原测定、HE，Masson染色、免疫组化检测肺组织结构，成（肌）纤维细胞特异性蛋白的表达。　　结果：　　1.构建的shRNA慢病毒能够有效降低LR-MSCs向成纤维细胞分化过程中以及博来霉素诱导小鼠肺组织内Wnt8b的转录水平，蛋白水平的表达;过表达慢病毒能够显著性提高Wnt8b的转录以及蛋白水平的表达。　　2.在LR-MSCs向成纤维细胞分化过程中，通过shRNA慢病毒抑制Wnt8b的表达，采用Real-time PCR、Western blot、免疫荧光检测成（肌）纤维细胞特异性蛋白的表达有明显降低，证明抑制Wnt8b能够抑制LR-MSCs向成纤维细胞分化。　　3.在小鼠肺间质干细胞中，过表达Wnt8b，通过Real-time PCR、Western blot、免疫荧光检测成（肌）纤维细胞特异性蛋白有明显的上升，证明上调Wnt8b的表达能够诱导LR-MSCs向成纤维细胞分化。　　结论：　　1.在小鼠肺间质干细胞向成纤维细胞分化过程中，证明Wnt8b通过激活Wnt/β-catenin信号通路能够促进LR-MSCs向成纤维细胞分化，特异性抑制Wnt8b能够抑制LR-MSCs向成纤维细胞分化。　　2.在博来霉素诱导小鼠IPF模型中，证明Wnt8b表达的升高能够促进纤维化，特异性抑制Wnt8b的表达能够有效干预特发性肺纤维的发生发展。