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目的：构建柯萨奇病毒（CVB3）结构蛋白VP1基因的真核质粒pBudCE4.1-VP1，并检测其在HeLa细胞中的表达，研究VP1蛋白对HeLa细胞形态、活性及细胞周期等方面的影响，为探讨CVB3的分子致病机制奠定基础。方法：1.质粒pBudCE4.1-VP1构建：抽提CVB3感染的HeLa细胞的总mRNA，RT-PCR扩增VP1基因，经KpnI和BglII双酶切后，克隆于真核载体pBudCE4.1中，酶切鉴定后进行DNA测序验证；2.质粒pBudCE4.1-VP1表达：将质粒pBudCE4.1-VP1转染HeLa细胞，采用Western blotting和间接免疫荧光技术检测VP1蛋白在HeLa细胞中的表达；3.质粒pBudCE4.1-VP1对细胞形态和活性的影响：质粒转染HeLa细胞后，倒置显微镜连续观察VP1蛋白对细胞形态的影响，通过MTT法检测HeLa细胞的活性变化；4.质粒pBudCE4.1-VP1对高尔基体的影响：采用免疫荧光双标技术分析质粒VP1蛋白对细胞高尔基体基质蛋白GM130结构的影响；5.质粒pBudCE4.1-VP1对细胞周期的影响：以G1/S期为切入点，应用流式细胞仪检测VP1转染后16h、20h、24h、28h、32h等时间点细胞周期的变化。结果：1.限制性内切酶酶切和测序结果表明VP1已成功插入pBudCE4.1载体的多克隆位点，其基因序列与CVB3m株（GI:323432）VP1基因序列完全一致。2. Western blotting和免疫荧光技术结果显示：质粒pBudCE4.1-VP1转染HeLa细胞后能检测到VP1蛋白的表达，且表达量随转染时间的延长而增加；3.质粒pBudCE4.1-VP1转染HeLa细胞后12h，部分细胞开始变圆；随着转染时间的延长，细胞出现较为明显的病变效应，到转染48h、60h后，几乎未见正常细胞。MTT法结果显示：质粒VP1转染的细胞与对照组细胞相比，OD值明显降低（P＜0.05），且转染时间越长，细胞活性越差；4.免疫荧光技术分析结果显示：质粒pBudCE4.1-VP1转染HeLa细胞后，随VP1蛋白表达量的增加，细胞蛋白GM130绿色荧光由带状分布趋于弥散，呈散在分布，且荧光强度减弱；5.细胞周期结果显示：质粒pBudCE4.1-VP1转染HeLa细胞16h、20h、24h、28h、32h后，与空质粒转染对照组G1期细胞相比，VP1转染组G1期细胞分别升高到：58.81%（P＜0.05），57.15%（P＜0.05），54.87%（P＜0.01），55.46%（P＜0.05），56.96%（P＜0.05）。结论：1.成功构建CVB3VP1基因真核表达质粒pBudCE4.1-VP1，并能在HeLa细胞中表达；2. VP1蛋白作用于HeLa细胞后可引起明显的细胞病变效应；3. VP1蛋白可引起高尔基带断裂，VP1蛋白可能是参与CVB3感染引起高尔基带断裂的主要病毒蛋白之一；4. VP1蛋白进入细胞后可将细胞周期阻滞在G1期。