论文部分内容阅读
高三尖杉酯碱（Homoharringtonine，HHT）是从三尖杉属植物中提取的一种生物碱。我国在70年代将其用于急性非淋巴细胞白血病（AML）和慢性粒细胞白血病（CML）的治疗取得良好疗效。早年认为HHT主要通过抑制蛋白质合成发挥抗肿瘤作用。近年的研究发现较高浓度的HHT主要诱导细胞凋亡，而低浓度HHT不引起细胞凋亡。临床采用小剂量长疗程HHT治疗AML取得一定疗效。本研究试图阐明小剂量HHT治疗的内在机理，为临床应用开阔思路并提供一定的理论依据。 我们以人急性红白血病细胞株K562细胞为对象，取5ng／ml，10ng／ml HHT作为实验浓度，采用MTT比色法观察小剂量HHT对K562细胞的生长抑制作用。结果发现，5ng／ml、10ng／ml HHT作用3天对K562细胞生长有一定抑制作用，抑制率分别为8.77±1.26％和20.28±1.55％。随作用时间延长，抑制作用增强。5ng／ml、10ng／ml HHT作用12天，对K562细胞的生长抑制率分别为33.33±3.02％和58.64±3.88％。提示5ng／ml、10ng／ml HHT对K562细胞的抑制作用在一定时间内具时效关系。小剂量HHT更好地发挥抗白血病作用可能需要延长治疗时间。 我们以Annexin VFITC标记及碘化丙啶（PI）染色后用流式细胞仪检测该浓度HHT对K562细胞凋亡的影响。结果发现，5ng／ml HHT作用3～12天后K562细胞无凋亡。10ng／mlHHT作用3天和6天后亦不引起K562细胞凋亡，作用9天和12天时少量细胞出现凋亡， 浙江大学硕土学位论文 gi率均为 11．8％。提示sngiml HHT对K562细胞的生长抑制与N亡无关，10nghl HHT 作用6天内的细胞生长抑制也与凋亡无关，随作用时间的延长，该浓度HHT对细胞的生长 抑制可能与诱导凋亡有部分关系。 近年来抑制端粒酶活性成为抗肿瘤治疗的靶点之一。人端粒酶逆转录酶（hTERT）是 端粒酶激活的决定性因素。以往研究己发现小剂量HHT可明显抑制白血病细胞的端粒酶活 性。为探讨小剂量HHT抑制端粒酶活性的机理，我们采用KruPP改良的荧光素标记端粒重 复扩增方法（TRAP）检测 K562细胞的端粒酶活性，同时用 RTPCR方法检测 K562细胞 hTERT 基因 mRNA表达的变化。结果发现，sngiml、10ng／ml HHT作用 3天和 6天后 K562细胞 的端粒酶活性及 hTERT mRNA的表达均显著下降，与细胞增殖能力下降一致。提示小剂量 HHT可能通过下调hTERT基因mRNA表达来抑制端粒酶活性，从而抑制K562细胞增殖。 导致端粒酶活性下阶的药物浓度在一定作用时间内并不引起凋亡，提示端粒酶活性和凋亡 的调节通路可能不同。有关端粒酶、端粒酶逆转录酶的调控机制尚不清楚，个别研究表明 c－myc基因可能参与hTERT基因表达的调控。因此我们也采用RTPCR方法检测了K562 细胞c－myc基因mRNA的表达，发现HHT作用后c－myc基因mRNA表达亦显著下降，与 hTERT mRNA表达和端粒酶活性的下调相一致。 为探讨小剂量HHT导致K562细胞端粒酶活性下降是否与细胞分化有关，本研究采用 紫外分光光度计比色法测定HHT作用后K562细胞内血红蛋白（Hb）含量变化。同时用流 式细胞仪检测成熟粒单细胞标记 CD！比及 HLA－DR的表达。结果显示：sng／ml HHT作用 3大利 6天后 K562细胞内 Hb含量有所增加，但与未处理组相比差异无统计学意义。而 10ng／，nl HHT作用 3天、6天后 K562细胞内 Hb含量与未处理组比分别增加了 l．96士0．23 o！1．86士0．22倍，差异有统计学意义。说明低浓度HHT作川一定时间后可能诱导K562细 胞向红系分化。同时发现sng／ml、10ng／ml HHT作用3大和6天后，K562细胞表面CDu 及HLA＊R的表达均无明显变化，提示小剂量HHT在一定作用时间内可能无诱导K562 细胞向粒单系成熟分化的作用。 综上所述，我们认为：（）小剂量 HHT（sng／ffil、10ng／ml）对 K562细胞生长有一定 2一抑制作用。随作用时间延长，抑制作用增强。（2）小剂量HHT显著抑制K562细胞的端粒酶活性，同时在转录水平抑制K562细胞hTERT基因及c－myc基因的表达。说明小剂量HHT可能通过下调hTERT基因表达来抑制端粒酶活性，c－myc基因可能参与这一过程的调控。 （3）小剂量 HHT在一定作用时间内抑制 K562细胞端粒酶活性与诱导细胞向红系分化有关，而与细胞凋亡无关。（4）sngiml、10nghl HHT在一定作用时间内可能无诱导 K562细胞向粒单系成熟分化的作用。