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目的： 充分利用人体外周血来源的树突状细胞(dendritic cells，DCs)强大的抗原提呈能力和激活T细胞尤其是初始型T细胞的能力，用肺癌细胞系Calu-6总RNA转染DC制成一种治疗性疫苗，观察这种疫苗体外诱导肿瘤患者抗原特异性抗瘤免疫的能力。 方法： 采集肺癌患者外周白细胞富集血，分离出单个核细胞，用贴壁方法分离单核细胞和淋巴细胞。非贴壁细胞一部分用小量IL-2维持生长，另一部分培养成为LAK细胞留作对照。贴壁的单核细胞在完全培养基加rhGM-CSF，rhIL-4及rhTNF-a的培养条件中培养7天获得成熟DC，光学显微镜及透射电镜下观察DC的形态，流式细胞仪确认成熟DC的表面标志。从肺癌细胞系Calu-6中提取总RNA，并通过参照基因GAPDH的RT-PCR结果来鉴定总RNA中mRNA的存在。不加TNF-a且只培养5天，经流式细胞仪鉴定为未成熟DC者用来转染肺癌细胞系Calu-6总RNA，转染时RNA需用脂质体包裹。流式细胞仪测定转染前后DC表面标志的变化。混合淋巴细胞增殖实验(MLR)比较转染前后的DC刺激异基因淋巴细胞增殖功能的差别。ELISA法测定转染前后DC分泌IL-12量的变化。转染后的DC与自体T淋巴细胞混合，诱导T淋巴细胞扩增为Calu-6抗原特异性CTL，流式细胞仪分析刺激前后淋巴细胞成分变化。LDH法测定CTL的杀伤活性，杀伤实验中的靶细胞使用Calu-6 RNA转染的DC(DC／Calu-6-RNA)，对照组用胃癌细胞系823 RNA转染的DC 天津医科大学硕士研究生论文 （DC／823－RNA），以及不经转染只加入脂质体的DC，比较CTL对这 三种靶细胞的杀伤率，此外还用这种CTL与LAK细胞同时杀伤 DC／Calu七－RNA和DC用23－RNA，比较特异性杀伤和非特异性杀伤的 差别。用 ＊O＊dU－6－RN A、＊＊用23JINA 和OC 分别再次刺激 0＊＊dU6伽A致敏的＊＊L，＊u＊A法分别检测三组＊＊L分泌117N－ Y的浓度。 结果： 提取肺癌细胞Calu－6总NA后，电泳显示RNA完整未降解，参 照基因GAPDH的RT－PCR结果证实总RNA中InRNA的存在。培养 的成熟单核细胞来源DC在光学显微镜和透射电镜下可见其细胞膜具 有树伎状突起的典型形态。流式细胞仪分析结果显示，与加 TNF－Q培 养 7天的DC相比，不加 TNF－口培养 5天的 DC特征性表面标志均未 达到成熟，符合转染用DC的要求。转染肺癌细胞系总RNA后，DC 的特异性表面标志CD，CD83及呈递功能相关表面标志CD86 （B7－2），HLA－DR表达均较未转染的DC升高，MLR结果显示DC 转染RNA后刺激异基因T淋巴细胞增殖的能力比未转染时增强，这 些都说明KNA转染DC后促进了未成熟DC向成熟DC方向的发展， 抗原提呈能力增强，而未转染组无这种变化，间接说明了RNA在DC 中得到了表达。Calu－6总RNA转染DC刺激自体淋巴细胞5天后 ＊D矿T细胞比例上升巾刃刀5），诱导出的＊＊L对具Culu＊抗原的特 异性靶细胞DC／C：IU－6－NA的杀伤率在效靶比40：l，20：l和10：l时 均明显高于对具非特异性抗原的靶细胞DC／823－RNA及单纯DC的杀 伤率巾吻刀5），在40＊和20：1时也高于LAK细胞对DCCulll6－RNA 和 DC侣23－RNA的杀伤率（p＜0刀5人但 LAK细胞对 DC／CalU6－RNA 和DC／823－RNA 的杀伤率高于CTL 对DC／823－RNA 的杀伤率 －4－ 天律医科大学硕士研究生论文 …吻．05人经DCC 七－RNA致敏的CDS＼细胞在受到同种抗原的 再次刺激下可以分泌IFN－Y，其浓度明显高于无关抗原DC／823－NA 刺激或单独用DC刺激致敏CDS”T细胞后分泌的IFN、Y（p＜0刀5人 结论： 肺癌细胞系Calu－6总RNA体外转染肺癌患者外周血单核细胞来 源的DC后，可以促进DC的成熟，并有效刺激T淋巳细胞增殖分化 为具有杀伤能力的抗原特异性CTL，特异性杀伤携带Catu－6肿瘤抗原 的靶细胞＊＊／＊dU－6－N A，这种特异性杀伤活性强于L＊K细胞对这 种靶细胞的非特异性杀伤，并且这种＊dU七特异性＊＊L对于携带无 关抗原的靶细胞 DC／823－NA也无特异性杀伤。Calu－6 NA转染 DC 后致敏的CDS＋T淋巴细胞在同一抗原的再次刺激下可以有效分泌促 进杀伤和吞噬的淋巴因于IFN－Y，分泌量高于用DC／823－RNA再次刺 激＊劝U乃致敏＊D矿T细胞分泌的WNWN－Y …叼刀5人本研究说明肺癌 细胞总NA转染DC在体外实验中是一种有效的治疗性肺癌疫苗，可 以诱导特异性抗瘤免疫杀伤肿瘤细胞，