子宫颈癌是全球女性中发病率仅次于乳腺癌的最为常见的恶性肿瘤，近年来其发病率呈升高和低龄化的趋势。据国际癌症研究中心报道，每年大约有493,243例宫颈癌新发病例，占女性新发肿瘤病例的16.2﹪。在我国，每年有新发宫颈癌病例约10万，其患病率居妇科恶性肿瘤的首位，死亡率在90年代为3.89/10万。人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是导致子宫颈癌发生的主要原因。尽管针对HPV6，11，16，18型的宫颈癌预防性疫苗已经问世，使宫颈癌一级预防成为可能，但对于现存宫颈癌患者的治疗，目前仍有很多问题需要解决。造成子宫颈癌治疗困难的主要原因之一即为肿瘤转移(metastasis)。 肿瘤转移是一个多因素、多步骤参与的生物学过程。转移的首要步骤为细胞迁移(cell migration)。细胞肌动蛋白骨架(actin)的重构(reorganization)是细胞迁移的第一步，即肌动蛋白在质膜皮质层下聚集，伸出伪足(pseudopodia)和突起(protrusion)，与细胞外基质黏附；随之细胞产生迁移所需的动力，细胞移位(translocation)，胞体回缩(retraction)，解除黏附。借助这一周而复始的生物学过程，细胞完成其动态的迁移过程。细胞肌动蛋白骨架重构受埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ezrin/radixin/moesin，ERM)家族调控。Moesin蛋白为该家族的成员之一，集中于富含肌动蛋白的细胞表面结构，如微绒毛、板状伪足等处。在未被激活状态下，其N端FERM区与C端交互作用，自行封闭其与胞膜、肌动蛋白的结合位点。细胞外信号刺激因子可通过改变分子构象而激活moesin蛋白，后者作为桥梁分子介导肌动蛋白与质膜的交联，引发肌动蛋白骨架发生重构，从而调控细胞生长、迁移。近年来的研究表明，ERM蛋白参与多种妇科肿瘤发展、浸润和转移的过程。但是，关于moesin蛋白在子宫颈癌发展和转移中的作用，目前国内外尚未有文献报道。 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族成员对宫颈癌的生长及转移具有重要影响。VEGF-C是VEGF家族的新成员，其促进肿瘤生长、侵袭和转移的作用已成为目前的研究热点。VEGF-C功能的发挥依赖于其与受体的结合，受体可分为VEGFR-2 (flk1)和VEGFR-3(Flt4)两类。研究证实，产生VEGF-C的肿瘤细胞具有更高的侵袭和转移能力。本课题组以往的研究也表明，VEGF-C在宫颈癌组织的表达程度与子宫颈癌的临床期别成正相关。但迄今为止VEGF-C促宫颈癌转移的机理尚未完全阐明。目前的研究认为，VEGF-C与其受体结合激活丝裂酶原活化蛋白激酶(MPAK)和蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路，刺激血管内皮细胞和淋巴内皮细胞的增生和迁移。新生淋巴管和血管在肿瘤生长转移中，为肿瘤组织提供营养物质，从而加速肿瘤的转移过程。但有研究报道，在培养的卡波济氏肉瘤细胞株上，观察到VEGF-C可直接促进肿瘤细胞的迁移；而VEGF-C突变体不能与VEGF受体结合，则对肿瘤细胞的迁移行为无明显影响。说明VEGF-C除有促进新生淋巴和血管形成的作用之外，也可促进肿瘤细胞本身的侵袭和迁移能力，但其内在的分子机制还有待进一步研究。 基于VEGF-C及moesin蛋白在多种肿瘤组织转移中的作用，本研究拟在组织和细胞水平上，从moesin蛋白的角度出发，结合目前VEGF-C促宫颈癌发生、侵袭和转移的研究热点，探讨moesin蛋白在VEGF-C促宫颈癌转移中的作用及其作用机制。 本研究将有利于揭示子宫颈癌转移的内在分子机理，为临床上开发出针对宫颈癌患者的全新有效的治疗药物提供重要的实验依据和思路，从而提高宫颈癌患者的治愈率和生存率。 研究目的 本课题研究分两部分。第一部分利用宫颈癌不同临床期别的新鲜癌组织标本，采用WesternBlot方法，测定肿瘤组织中VEGF-C和moesin蛋白、P-moesin的表达量，并观察三者表达量的变化是否与宫颈癌的临床分期、病理学分级存在相关性。第二部分在培养的宫颈癌细胞株Hela细胞上，观察VEGF-C对moesin蛋白表达和蛋白磷酸化的调控作用。并进一步利用反义寡核甘酸转染技术，观察moesin蛋白在VEGF-C促宫颈癌细胞肌动蛋白骨架重构及细胞迁移中的作用。 研究方法 1．选取2005年6月1日～2006年8月1日期间中山大学附属第一医院诊治的11例宫颈CINⅢ，14例宫颈鳞癌Ⅰ期，8例宫颈鳞癌Ⅱ期(未行放疗和/或化疗，简称未放化疗组)，8例宫颈鳞癌Ⅱ期(已行放疗和/或化疗，简称放化疗组)作为研究对象。组织标本取自活体或新鲜手术标本，同时取同期因子宫肌瘤行子宫切除的正常宫颈组织10例作为对照。 2．提取上述各组标本的组织蛋白。蛋白定量后利用Western blot技术采用图像处理系统对Western blot图片进行扫描，测定感光区带的感光密度进行蛋白的定量测定，分别测定VEGF-C蛋白、moesin蛋白和磷酸化moesin(P-moesin)蛋白的含量。实验分组：①正常对照组；②CINⅢ组；③宫颈鳞癌Ⅰ期组；④宫颈鳞癌Ⅱ期组(未放化疗组)；⑤宫颈鳞癌Ⅱ期(放化疗组)。 3．在培养的宫颈癌Hela细胞株的细胞上，分别加入VEGF-C及VEGF-C单克隆抗体作用24h后，利用Westernblot技术测定moesin蛋白、磷酸化moesin(P-moesin)蛋白的含量(具体测量方法如研究方法2中所述)，观察VEGF-C对moesin蛋白表达及moesin蛋白磷酸化的作用。实验分组：①对照组：②VEGF-C处理组；③VEGF-C+VEGF-C单克隆抗体组。 4．在培养的宫颈癌Hela细胞株的细胞上，采用免疫荧光技术观察VEGF-C对肌动蛋白骨架重构的作用。实验分组：①对照组；②VEGF-C处理组；③VEGF-C+VEGF-C单克隆抗体组；④VEGF-C+转染moesin反义寡核甘酸组；⑤VEGF-C+转染moesin正义寡核甘酸组：⑥moesin反义寡核甘酸组；⑦moesin正义寡核甘酸组。 5．在培养的宫颈癌Hela细胞株的细胞上，观察VEGF-C对宫颈癌细胞迁移的作用。实验分组：①对照组；②VEGF-C处理组；③VEGF-C+VEGF-C单克隆抗体组；④VEGF-C+转染moesin反义寡核甘酸组；⑤VEGF-C+转染moesin正义寡核甘酸组；⑥moesin反义寡核甘酸组；⑦moesin正义寡核甘酸组。 6．统计方法：本研究的定量结果采用均数±标准差(Mean±SD)表示，各组间的差异采用单因素方差分析检验，P<0.05被认为差异有统计学意义。结果的统计分析采用SPSS 9.0软件。 结论 1．宫颈癌组织中VEGF-C、moesin、P-moesin蛋白含量随着宫颈癌临床分期的增加而增加，提示VEGF-C及moesin、P-moesin蛋白在宫颈癌的侵润发展中发挥重要作用。放化疗可明显下调宫颈鳞癌Ⅱ期组织中的VEGF-C、moesin蛋白表达水平及磷酸化水平。 2．在宫颈癌Hela细胞上，VEGF-C通过上调moesin蛋白表达水平及其磷酸化，从而引发Hela细胞肌动蛋白骨架重构，进而促进细胞本身的迁移。