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背景与目的T细胞在胸腺经历CD4~-CD8~-双阴性、CD4~+CD8~+双阳性和CD4~+/CD8~+单阳性阶段而逐渐发育成熟,单阳性阶段的胸腺细胞表达1~-磷酸鞘氨醇受体1(Sphingosine~-1~-phosphate receptor 1,S1P1)等分子,在相应趋化因子作用下离开胸腺到达外周定居。S1P1是T细胞迁出胸腺的关键分子,其表达受FoxO1~-KLF2~-S1P1调控。FoxO1(forkhead transcription factors of the O class 1)是一种重要的转录因子,在细胞核内与同源DNA序列结合促进Kruppel样因子2(Kruppel~-like factor 2,KLF2)表达,继而KLF2影响CCR7、CD62L和S1P1等分子的表达。TCR活化信号能通过PI3K~-AKt信号通路使细胞核中FoxO1磷酸化并使其转移至胞浆[1],同时失去对下游转录因子KLF2和下游分子S1P1等表达的促进作用,并因而影响胸腺细胞的迁出。我们在前期工作中已报道重症肌无力(myasthenia gravis,MG)患者胸腺组织FoxO1、KLF2和S1P1表达均高于对照组,为进一步阐明MG患者胸腺和外周T细胞亚群异常在疾病发生中的作用,本文对患者CD4~+胸腺细胞表达FoxO1及其对下游分子KLF2、CCR7、CD69、S1P1的表达进行了研究。考虑到患者胸腺细胞的个体差异性以及Jurkat细胞本身的特征,在本研究对来自患者的CD4~+胸腺细胞和Jurkat细胞系进行研究,观察FoxO1磷酸化及去磷酸化对这些细胞下游转录因子KLF2及S1P1表达的变化。方法1.研究对象:4例开胸手术获得的非自身免疫性先天性心脏病者的正常胸腺组织,经过无菌处理并制备胸腺细胞悬液。取出液氮中冻存的Jurkat细胞于37°水浴锅中快速复苏,然后将细胞移至15ml无菌离心管,向其中一滴一滴加入含有10%胎牛血清1640培养液,边加边晃,300g 4℃离心10min,弃上清,向其中加入含有10%胎牛血清1640培养液5ml,于37°5%CO2饱和湿度培养箱内进行培养,隔天换液、每天显微镜下观察细胞的生长状况。然后选取对数生长期的Jurkat细胞进行试验。2.免疫磁珠法分选出CD4~+胸腺细胞:吸取单个胸腺细胞悬液10μl进行计数,向1x107个细胞(10μl)加入80μl分选Buffer,再加入20μl CD4单抗,充分混匀后4℃避光孵育15min,再加入2ml Buffer混匀,300g 4℃离心10min,弃上清,向其中加入500μl Buffer反复吹打使细胞重悬,然后再将MS柱子放入磁力架中,加入0.5ml PBE润细,在重力作用下自然流尽,反复洗涤后将分离柱移出磁场,加入Buffer并收集,即得到CD4~+胸腺细胞。3.FoxO1磷酸化和去磷酸化试验:分别将CD4~+SP胸腺细胞和Jurkat细胞分成三组,第一组为FoxO1磷酸化组。以5μg/ml CD3单抗的包被液将6孔板进行包被,4℃冰箱过夜处理,弃去包被液,加入含1μg/ml CD28单抗和10%胎牛血清的浓度为2×10~6个/ml细胞悬液2ml;第二组为FoxO1去磷酸化组。在2×10~6个/ml细胞悬液加入PI3K-AKT信号通路特异性抑制剂LY29400212.5μg/ml;第三组为对照组(control)。以含有10%胎牛血清1640培养液孵育;放于37°5%CO2饱和湿度培养箱孵育48h,收集细胞。4.FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69 mRNA的表达:分别提取各组细胞总RNA,采用荧光定量PCR法检测FoxO1、KLF2、S1P1、CCR7、CD69 mRNA的表达水平,采用2~-△△Ct法分析FoxO1磷酸化组、FoxO1去磷酸化组与对照组比较各基因的相对表达差异。5.FoxO1、KLF2、S1P1、P-FoxO1蛋白的表达情况:分别提取各组细胞的总蛋白,通过Western blot定量法检测比较FoxO1、KLF2、S1P1、P-FoxO1蛋白水平,分析其蛋白表达差异。6.统计学分析数据统计均用均数±标准差来分析,应用SPSS 21.0统计软件进行分析数据。2组样本之间的比较采用t检验,数据应用GraphPad Prism5.0进行分析。结果以P<0.05被视为差异具有统计学意义。结果1.CD3和CD28单抗对CD4~+SP胸腺细胞FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69表达的影响:Real-Time PCR检测各组FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69 mRNA水平的变化。结果表明,FoxO1磷酸化组FoxO1、KLF2、S1P1、CCR7 mRNA水平与空白对照组相比均显著降低(P<0.05)。而CD69 mRNA水平与空白对照组相比发生显著增高(P<0.05)。2.PI3K-AKt信号通路特异性抑制剂LY294002对CD4~+SP胸腺细胞FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69表达的影响:Real-Time PCR检测各组FoxO1、KLF2、S1P1、CCR7、CD69 mRNA水平的变化。分析结果表明,FoxO1去磷酸化组FoxO1 mRNA水平与空白对照组相比显著升高(P<0.05),而KLF2、S1P1 mRNA水平与空白对照组相比均发生显著降低(P<0.05),而CCR7、CD69 mRNA水平与空白对照组相比均发生显著降低(P>0.05)。3.CD3和CD28对Jurkat细胞FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69表达的影响:Real-Time PCR检测分别处理3h、6h、12h、24h、48h各组的FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69 mRNA水平的变化。CD3和CD28处理48h后的结果表明,FoxO1磷酸化组FoxO1、KLF2、S1P1、CCR7 mRNA水平空白对照组相比均发生显著降低(P<0.05)。CD69 mRNA水平空白对照组相比发生显著增高(P<0.05)。4.PI3K-AKt信号通路特异性抑制剂LY294002对Jurkat细胞FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69表达的影响:Real-Time PCR检测分别处理3h、6h、12h、24h、48h各组的FoxO1、KLF2、S1P1、CCR7、CD69 mRNA水平的变化。LY294002处理48h后的结果表明,FoxO1去磷酸化组FoxO1、KLF2、S1P1 mRNA水平与空白对照组相比均显著升高(P<0.05),而CD69 mRNA水平与空白对照组相比显著升高(P>0.05),CCR7 mRNA水平与空白对照组相比显著降低(P>0.05)。5.FoxO1磷酸化和FoxO1去磷酸化对Jurkat细胞P-FoxO1、FoxO1、KLF2、S1P1蛋白表达的影响:CD3和CD28联合处理48h后的FoxO1磷酸化组FoxO1、KLF2、S1P1蛋白表达水平与空白对照组比较显著降低(P<0.05),P-FoxO1蛋白表达水平与空白对照组比较显著升高(P<0.05)。PI3K-AKt信号通路特异性抑制剂LY294002处理48h的FoxO1去磷酸化组FoxO1、KLF2、S1P1蛋白表达水平与空白对照组比较显著升高(P<0.05),P-FoxO1蛋白表达水平与空白对照组比较显著降低(P>0.05)。结论FoxO1磷酸化和去磷酸化是调节未成熟T细胞功能状态的重要因素。