本文旨在研究小穴壳菌属(Dothiorellasp.)真菌HTF3中，与Cytosporone B合成相关的聚酮合酶。在HTF3的生长过程中，产生了一系列聚酮化合物，其中的Cytosporone B具有较好的抗真菌和细胞毒活性，有潜在的药用价值。希望通过对Cytosporone B聚酮合酶基因的研究，揭示其生物合成途径，为改造和应用该化合物奠定基础。同时，还希望在研究过程中，建立起一套可行的方法，以便于广泛开展真菌的次级代谢产物研究。 本文研究内容主要包括：构建HTF3基因组文库，利用同源探针筛选文库获得含PKS基因的克隆子；分析克隆子插入序列的开放阅读框，获取完整的PKS基因；通过同源重组敲除聚酮合酶基因，研究该基因与Cytosporone B的关系。 通过简并引物PCR从HTF3基因组中扩增获得聚酮合酶基因片段0601和1101，序列比对结果显示，0601属于非还原型聚酮合酶基因，1101属于部分还原型聚酮合酶基因。根据对Cytosporone B合成途径的推导，认为0601与Cytosporone B合成有关，因此选择0601作为筛选文库的同源探针。 HTF3基因组文库采用黏粒载体Supercos 1进行构建，文库构建效率为5×103克隆数/μgDNA。采用0601探针进行Southern杂交后，从文库中得到一个阳性克隆。 通过对插入片段两端序列的分析，认为阳性克隆中可能含有完整的聚酮合酶基因，并通过步移法从阳性克隆上PCR获得该基因的完整序列，命名为pks0601。pks0601全长5340bp，编码的蛋白质中含有5个可能的功能域，分别是Ks、AT、2个PP-binding域和TE，但没有参与B酮基还原步骤的功能域，为典型的非还原型聚酮合酶结构。序列比对发现，该PKS与Colletotrichum lagenarium中合成真菌黑色素(melanin)前体THN的聚酮合酶PKS1有较高相似性。 从阳性克隆的pks0601基因上、下游各截取一段序列，并在其中接入报告基因潮霉素抗性基因hph，以pGEX-4T-2为载体构建得到了敲除质粒pGK55hyg，希望通过同源重组敲除HTF3基因组中的pks0601，以检测基因缺失对Cytosporone B代谢的影响。pGK55hyg采用原生质体-PEG法转化HTF3原生质体，为获得理想的转化效率，事先优化了原生质体制备和再生的条件，确定以含1.5％溶壁酶、1.5％纤维素酶和1.0％蜗牛酶的溶壁酶混合液制备原生质体，并以含1mol/L NaCl的PDA(50％海水)作为再生培养基。 pGK55hyg转化HTF3后，经过潮霉素B筛选获得6个转化子。转化子经PCR检测，证实hph已经转入基因组中，但0601未被敲除。通过薄层色谱(TLC)检测转化子的发酵液，均有Cytosporone B信号产生。目前，这些结果还无法说明pks0601与Cytosporone B的关系，实验仍在进行中。