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细胞在增殖过程中最重要过程的是其间期的DNA复制。他受到多方面的因素影响。其中其复制起点对其影响尤为重要,它的异常可能会导致癌症等多种疾病的产生。而酵母作为模式生物之一,它有着真核生物和原核生物双重特点,是作为研究复制起始位点的优良实验材料。酵母复制的起始位点称为自主复制序列(ARS),其III号染色体上的ARS约有19个,其使用频率各不相同,通过高通量的核小体定位发现,在ARS侧翼上出现核小体的分布各有不同,由此可见ARS两侧序列可能会影响ARS的活性。 本实验通过PCR扩增酵母III号染色体上的ARS304、ARS305及其侧翼序列。并以整合型载体pRS405为基础构建重组质粒PARS304,PARS304-500,PARS304-2000。为了鉴定ARS304、ARS305不同侧翼序列对酿酒酵母的自主复制活性的影响,将构建好的重组质粒以及本实验室原有保存的载体PARS305,PARS305-500,PARS305-2000通过电转化方法转化至酿酒酵母细胞。酵母感受态细胞为缺陷型细胞,pRS405载体上含有亮氨酸标记但必须整合到酵母基因组上才能表达,而由于搭载有ARS序列的载体可以游离于基因组之外独立表达合成亮氨酸,所以通过验证其转化子个数,从而计算转化频率。在此过程中对电转化进行条件优化,通过均匀设计对电场强度、外源DNA量和酵母生长状态对电转化的影响。当电场强度在1750V,酵母OD值在1.3,外源DNA量在600ng时,转化率最高。在此条件下测定质粒丢失率。经计算PARS304转化率为389-412转化子/μg,质粒每代的丢失率为16.2％;PARS305转化率为523-551转化子/μg质粒,每代的丢失率为11.2%;PARS304-500转化率为476-497转化子/μg质粒,每代的丢失率为14.7%;PARS305-500转化率为723-734转化子/μg质粒;每代的丢失率为9.01%,PARS304-2000转化率为623-632转化子/μg质粒,每代的丢失率为9.35%;PARS305-2000转化率为929-939转化子/μg,质粒每代的丢失率为8.1%。这说明构建的重组质粒在酵母中都是不稳定的,都可以进行自主复制。且ARS305及其侧翼序列转化率高于ARS304,随着侧翼序列的增长其自主复制活性增高。 本实验后续工作在PARS-500,PARS-1000,PARS-2000。重组质粒上组装核小体,研究重组质粒上核小体的分布及核小体定位对复制起始活性的影响,为以酵母作模式生物研究真核基因的复制与转录机制提供了有益的线索。