如何对细小的染色体异常做出准确的核型分析一直是困扰产前诊断技术人员的技术难题之一。传统的染色体显带核型分析由于其分辨率较低,往往难以对复杂易位做出准确判断,而且操作费时费力。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)虽然与G带相比具有简便、快速、特异性高等优点,但是FISH技术往往要建立在已知的核型分析基础上,对没有任何可以确定的条带模式的未知染色体异常,检测就变得十分困难。频谱核型分析(SpectralKaryotyping, SKY)这种新式的全染色体着色技术允许在一次试验里使每一条染色体都清楚地按照不同的颜色呈现出来,并进行同步鉴定和分析,而且能识别染色体显带技术和单用FISH难以确认的一些畸变,为准确地诊断复杂核型异常提供了可能。目前,国内对SKY技术研究和临床应用还不够全面和深入,特别是对SKY染色体制片及如何与其他技术有效结合建立可行的操作模式研究比较欠缺。本实验观察并分析了各种实验变化因素对制片过程的影响,以及SKY技术、G带技术和FISH在临床上的应用,以求为制片技术标准化及进一步阐明三者的作用及如何进行有效分析提供思路,并为建立有序的临床诊断规范提供实验依据。 目的: 1.观察滴片高度、固定液比例、滴片方法等因素对SKY制片的影响作用并浙江大学硕士学位论文 探讨其机制。2.应用改良后的方法建立适合国情的SKY技术体系应用于临床诊断。3.探索SKY技术在妇产科领域诊断复杂核型异常中的应用,研究G带、FISH、 SKY技术在产前诊断中的应用并探讨如何建立有效结合的规范流程。方法: 1.用染色体分裂相大小、交叉数目、破裂频率来评估制片过程中的各种因素 对制片结果的影响。 2.通过蒸汽制片和化学法结合的改进方法与常规方法比较,探索SKY制片问 题的解决方案,从而建立SKY技术体系。 3.应用SKY、F工SH、G带结合分析临床病例,探讨各种技术的作用,及建立 规范的临床诊断流程。结果: 第一部分SKY制片技术及其可能的影响机制1.滴片高度Icm到30cm对SKY制片结果影响不大。2.固定液比例的改变从2:1到4:1浓度对SKY制片结果有一定影响,比 例越大,染色体分裂相破裂越少,但有变小趋势、3:1的比例比较适中。3.应用改进后的蒸汽法和化学法结合的新方法能使染色体分裂相有效扩 散,并达到制片要求。4.离心速度对染色体分裂相的质量有一定程度的影响,相对于常规的6OOXg 离心速度,采用24OXg能够有效解决细胞质和杂质残留的问题,使制片 背景清晰。第二部分SKY技术在临床诊断上的应用及和其他方法的有效结合 建立的适合国情的SKY技术体系能有效应用于临床诊断,在产前诊断中 复杂的染色体异常及标记染色体来源都得到了一一鉴别。浙江大学硕士学位论文2.病例1一24,SKY的分析结果与G带相符合,显示为正常的染色体核型。3.病例25一28:SKY技术在G显带分析结果的基础上进一步揭示出标记染色 体的来源于6,14,16号染色体,FISH证实了SKY的结果。4.病例29 SKY诊断是正确的,但是需要F工SH技术来确认.G显带分析显示 5号染色体的长臂的末端存在着不明来源的细小的标记染色体,经过DAPI 图像分析揭示这个不知名的片段源于Y染色体,SKY结果清晰的揭示了这 个易位,但是由于荧光信号闪烁的干扰,最后需要FISH确认了这个异常。5.病例30先进行SKY尝试性诊断,然后选择FISH探针来鉴别标记染色体 的来源。G带结果提示存在着一个小的不明来源的易位,经过SKY技术的 分析,提示标记染色体可能来源于8,11,21号染色体,经过多个图像 的比对,8号染色体的频率最高,通过应用F工SH探针8,n,21,确 定了标记染色体确实来自于8号染色体。结论:1、应用蒸汽法和化学法结合的制片方法能够持续稳定地得到高质量的染 色体分裂相,可获得良好SKY制片效果。2、我们所建立的SKY技术已达到了SKY技术分析染色体必须达到的质量 标准,其分辨率大小可达1.SMB。显色层次分明,已可用于临床诊断。3、SKY技术能对许多复杂的染色体重排作出快速诊断;而对于不明来源的 标记染色体也能够根据其染色体颜色的不同快速的确定其来源。克服了 传统染色体显带分析技术的缺点和荧光原位杂交技术的局限。SKY技术 不是对G带和FISH技术的简单的替代,而是非常有益的补充。通过三 者的有效结合,可有效地解决产前诊断中的疑难病例的诊断。4、根据对实验结果的分析和总结,我们所推荐的在产前和产后诊断中比较 合理的染色体分析技术的操作流程是:首先运用G显带分析进行筛查; 其次SKY分析(当需要鉴别标记染色体时);再接着是FISH技术(有怀 疑,需要确诊时),有两点需要注意的是,首先如果G带可以鉴别出明 确的额外染色体的来源时,SKY这一步就可以省略,而应用FISH确认。