戊二酰亚胺聚酮家族化合物是一类具有多种生物活性的天然产物,极具发展成为新型抗肿瘤药物制剂的潜力。该家族化合物一般由戊二酰亚胺的六元环和长短不一的聚酮环或聚酮链侧链所组成,主要成员包括iso-migrastatin、migrastatin、dorrigocin、lactimidomycin、cycloheximide、streptimidone和9-methylstreotimidone.等。其中,migrastatin及其结构类似物能够阻碍癌细胞的迁移,目前已经进入药物研发的阶段;dorrigocins能够抑制与Ras相关蛋白的甲基转移酶活性;lactimidomycin具有阻碍癌细胞迁移的活性和阻止真核生物蛋白转录起始的作用,显示出非常好的细胞毒性;放线菌酮（cycloheximide）同样也可以阻止真核生物钟的转录,该化合物和lactimidomycin已被开发成分子生物学工具来研究真核生物DNA转录中真正的转录单元。Iso-migrastatin（iso-MGS）是由平板链霉菌NRRL18993所产生的化合物,是戊二酰亚胺聚酮家族中最晚被发现,但最具代表性的一个化合物。Iso-migrastatin特殊的化学结构极有可能对应着独特的生物合成机制,其生物合成也一直是人们研究的重点,但其生物合成途径中至今还存在着多个关键步骤尚未被解决。例如,iso-migrastatin和lactimidomycin具有相似的生物合成基因簇,但却分别产生C17位无轻基基团的iso-migrastatin和C17位有轻基基团的lactimidomycin,且参与C17位修饰的酶至今仍未见报道。同时,C17位的羟基是戊二酰亚胺聚酮类化合物的重要活性基团,该羟基的存在会导致其生物学活性的IC50值从μM级别提高到nM级别。因此,解决iso-migrastatin生物合成中C17位轻基催化机制对后续结构改造和优化有着十分重要的意义。本研究选取pBSl 1001（包含完整iso-migrastatin基因簇的BAC）作为研究对象,对其生物合成途径中缺失的脱水酶进行研究。基于之前对于iso-migrastatin基因簇（mgs基因簇）的研究结果,分别选取了位于module 6、module 9和module 11的三个DH domain（分别命名为DH6、DH9和DH11）进行活性位点的氨基酸突变,造成其功能缺失。实验结果表明只有DH9和DH11功能缺失的突变株能够产生新的iso-migrastatin和dorrigocin类似物,而DH6的功能缺失突变株则完全丧失合成iso-migrastatin的能力。因此,本研究的重心逐渐转移到了module 10中的DHdomain（DH1O）。在之前的研究中,DH10因缺少一个保守的HxxxGxxxxP区域而被认为是一个无功能的DH domain。然而在更加细致的序列比对之后,发现DH10中的HxxxGxxxxP区域被一小段氨基酸序列分割成两个部分,因而推测DH10应该是一个有功能的domain。对DH10的关键氨基酸的点突变使其丧失功能,并分析DH10突变株的代谢产物情况,分离出3个新的iso-migrastatin结构类似物,且C17位均含有轻基基团,从而成功地鉴定出与C17位羟基化有关的DH domain。为了进一步确定DH10的功能,本研究采用体外酶学手段对C17羟基脱水的具体时间进行研究,以确定脱水反应究竟发生在module 4还是module 10上。通过在大肠杆菌中过表达DH10,成功获得了具有活性的重组蛋白。通过化学合成的方法合成了短链的底物来模拟连接在module 4上的底物,同时利用DH10和DH11的双突变菌株富集到链接在module10上的底物。在优化酶反应的pH值以及缓冲溶液后,通过一系列底物的反应,发现DH10只能选择性催化长链的化合物,实验结果表明DH10实际上作用于module 10,从而催化C17位脱水反应。通过酶动力学分析,计算出DHlO的Km’值是7.9±0.75mM,Kcat’值是10.35±0.47min-1。使用DH10催化在C3和C17同时存在两个羟基的完整长链化合物,结果显示DH10能够同时催化C3位和C17位的羟基,但是远端C17位的脱水反应是主要的催化反应。体外实验进一步证明了O1110能够催化远端C17位上的轻基,但该DH domian位于module 10,因此DH10催化C17位羟基具有独特性。至此通过体内和体外实验,从两个方面分别证明了 mgs基因簇中module 10上脱水结构域的功能,通过文献查阅和数据库比对,该具有特殊的脱水酶结构域属于世界首次报道。此外,在近期报道的三个戊二酰亚胺类家族的基因簇（iso-MGS基因簇,LTM基因簇和CHX基因簇）中,MGS和CHX基因簇中均存在着各自的调控基因mgsA和chxA,而LTM生物合成基因簇中却不存在任何调控基因。之前的实验显示,mgsA基因敲除突变菌株无法继续产生MGS,同时将包含iso-MGS基因簇的BAC质粒在多种放线菌宿主中进行了异源表达,通过RT-PCR对与生物合成相关的基因进行分析,发现调控基因mgsA几乎没有表达。这些现象与调控因子的基因功能和定义相互违背,因此本研究将对这类调控基因的功能进行研究。利用游离型质粒pUWL201PW和pKC1139,分别构建了mgsA和chxA的过表达质粒,并在多种宿主中进行该基因的过表达。通过HPLC分析,发现在产iso-MGS的菌株中过表达mgsA和chxA这两个基因,仅使代谢产物的产量提高不到10%,推测原因是由于iso-MGS基因簇本身就拥有途径特异的调控子,增加其拷贝数对基因簇的调控没有叠加效应。与iso-MGS类似,mgsA和chxA同样没有明显提高CHX的产量。但是在Lactimidomycin表达菌株中引入mgsA和chxA后,可导致Lactimidomycin基因簇过量表达,与野生型菌株（25mg/L）相比,过表达的两株重组菌株中LTM的产量（106 mg/L）提高了4倍,为LTM的工业化生产提供了理论基础。