天然产物是一类由微生物或植物产生的具有多种多样活性的小分子,其相应的产品在医疗和农业等领域发挥着重要的作用,经过几十年的不断发掘依然是药物开发的重要资源。其中,聚酮类化合物具有多变的结构和丰富的生物活性,已经广泛地用于临床治疗和生产。五元角环多酚是一类由24-30个碳原子的聚酮链前体缩合形成的芳香类化合物,因其五元角环的核心结构而得名,具有复杂多样的结构和极好的生物学活性,在医药领域有着广泛的应用前景。传统的天然产物开发手段耗时耗力,并且重复发现率高,已经遭遇到瓶颈。随着基因组测序技术不断地发展,微生物基因组的巨大潜能被揭示了出来。本研究拟通过基因组挖掘的手段,从放线菌这一重要的天然产物产生菌中寻找新的五元角环多酚类化合物。论文采用了两种研究的方法:一是对菌株Streptosporangiumsp.CGMCC 4.7309进行全基因组测序,结合生物信息学分析来发掘其中的五元角环多酚;二是使用基于同源性的PCR筛选策略,从不同来源的放线菌中筛选具有产生五元角环多酚合成基因的菌株,进一步获得各种新结构的五元角环多酚。之前的研究已经从链孢囊菌（Streptosporangium）中分离得到多种有活性天然产物,而NCBI公开的基因组数据显示链孢囊菌具有很强的次级代谢产物产生潜力,因此本研究选择菌株Streptosporangiumsp.CGMCC 4.7309进行全基因组测序。使用antiSMASH在线分析了菌株S.sp.CGMCC 4.7309的全基因组序列,结果发现了超过20个次级代谢产物生物合成基因簇,包含聚酮、非核糖体多肽、羊毛硫抗生素和萜类等,并从中找到了可能参与合成五元角环多酚的Ⅱ型聚酮合酶基因簇。该基因簇包含33个开放阅读框,将基因簇中各个基因所编码的蛋白进行在线BLAST比对,并对它们的功能进行了预测。对其中的Ⅱ型聚酮合酶Hex23与已知五元角环多酚基因簇中的同源蛋白进行系统进化树分析,推测该基因簇合成的五元角环多酚骨架长度应为26个碳原子。多重序列比对分析了可能影响框架结构的Baeyer-Villiger氧化酶Hex18和天冬酰胺合成酶Hex6,发现它们都具有这类酶的活性位点,最后完成了对其基因簇产物整体结构的预测。本研究通过去除额外添加的2价阳离子的方法,首次建立了链孢囊菌-大肠杆菌的遗传转化体系;并敲除了五元角环多酚合成起始阶段重要的酮基还原酶Hex30。通过比较基因敲除突变株和野生型菌株的代谢谱找到了该基因簇所对应的五元角环多酚类化合物。经过分离纯化,得到了 3个化合物,分别为hexaricinA、hexaricin B和新化合物hexaricinC。通过LC-MS和NMR分析确定了 hexaricins平面结构,并通过理论计算与实验数据（比旋光度和圆二色谱）的比较确定了3个化合物的绝对构象,最终对化合物的生物合成途径进行了推测。依赖同源性的PCR筛选策略在天然产物产生菌的基因组挖掘上已经取得了很多成果,发现了许多具有不同生物活性的新化合物。五元角环多酚由Ⅱ型聚酮合酶催化合成,之前已报道的筛选策略大都是以聚酮合酶中的酮基合酶基因KSβ为靶点设计探针,这一方法并不能特异性地筛选出含有五元角环多酚合成基因簇的菌株。分析所有已报道的五元角环多酚基因簇发现,在五元角环多酚基因簇中有两个特异的单加氧酶基因,并且只存在于五元角环多酚基因簇中。因此,这两个基因可以作为靶点设计探针,通过PCR策略就能特异性地筛选出五元角环多酚产生菌。通过对这类单加氧酶的多重序列比对,总共设计了6对简并引物,并以其中的3对引物完成了对318株放线菌的PCR筛选,总共发现了 14个阳性菌株,其中可以用1对引物筛选出所有的14个阳性菌株,其通用性最好,能够用于后续五元角环多酚基因簇的大规模筛选。之后选取其中同源性很高的菌株Streptomyces champavatii CGMCC 4.1615,同源性适中的菌株Streptomyces sp.1.093和Streptomyces sp.B81进行全基因组测序。AntiSMASH分析发现这3株菌中均含有五元角环多酚基因簇,证明了此方法的可靠性。菌株S.champavatii CGMCC 4.1615的五元角环多酚基因簇含有32个开放阅读框,而Streptomyces sp.1.093和Streptomyces sp.B81的五元角环多酚基因簇均含有55个开放阅读框。使用在线BLAST推测了各基因的功能,结果显示菌株S.champavatii CGMCC4.1615中的五元角环多酚基因簇与已知的fredericamycin的基因簇几乎完全一致（其发酵液颜色和代谢产物紫外吸收也符合五元角环多酚的特征）;菌株Streptomyces sp.1.093和Streptomyces sp.B81中的五元角环多酚基因簇与xantholipin基因簇具有较高的相似性,蛋白进化树分析显示它们与xantholipin具有相同的碳链长度26个;而多重序列比对分析酶的活性位点也显示它们可能产物也可能具有与xantholipin类似氧杂环和内酰胺结构。将菌株Streptomyces sp.B81在不同培养基中进行发酵,没有发现五元角环多酚类化合物。可能是由于在一般条件下,其中的五元角环多酚基因簇处于沉默状态。本研究构建了基因簇中的可能正调控基因cds12、cds20、cds47、cds50的过表达菌株和可能负调控基因cds6的敲除菌株,尝试激活沉默的基因簇。发现在过表达正调控基因cds11和cds12时,都产生了新的色素,HPLC显示有新化合物的产生,并符合五元角环多酚的特征吸收,因此判断五元角环多酚生物合成基因簇已被激活。最后选择了激活效果最好cds12过表达菌株进行发酵,同时确定了目标化合物产量较高的ISP3作为发酵培养基。发酵液在调节pH值后,经过丙酮浸提浓缩,乙酸乙酯萃取,硅胶柱层析得到了纯度较高的目标化合物,由于化合物纯度提高后在甲醇中溶解度变低,可以通过甲醇洗涤去除部分杂质。该化合物的结构鉴定还在进行中。