酶法制备牡蛎活性肽及其诱导Hela细胞凋亡的研究

来源 :汕头大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ywl1241
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目的:酶法制备牡蛎活性肽并探讨其诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡的作用及机制。  方法:  (1)采用响应面法优化了复合酶水解牡蛎蛋白的工艺。  (2)在温度45℃、pH8.0的条件下,通过探讨底物浓度及酶浓度对水解度的影响,建立酶解牡蛎蛋白的动力学模型。  (3)采用Sephadex G-25柱层析法对酶解液中的牡蛎活性肽进行分离纯化,并通过Trcince-SDS-PAGE电泳和凝胶过滤层析法测定其相对分子质量大小。  (4)以SRB(Sulfordmaine B磺基罗丹明B)比色法,台盼蓝计数法,Hochest/PI双荧光染色法和DNA Ladder等技术方法检测BPO(Bioactive peptides of oyster)诱导Hela细胞凋亡的方式,并采用流式细胞术和实时定量PCR(RT-PCR)从分子水平上分析了BPO诱导Hela细胞凋亡的作用机制。  结果:  (1)牡蛎蛋白的最佳酶解工艺为:温度45℃、复合酶浓度2g/L、底物浓度15.3g/L、复合酶比(风味蛋白酶与胰蛋白酶活力比)为2.3:1;  (2)复合蛋白酶在温度45℃、pH8.0的条件下,水解牡蛎蛋白的动力学方程及参数为:水解速率模型R=(40.301E0-0.4257S0)exp(-0.2176DH)和水解度动力学模型DH=4.5956ln[1+(8.7695E0/S0-0.09263)t],动力学失活常数Kd=8.5378min-1和米氏常数Km=3.741mg/mL;  (3)纯化得到牡蛎活性肽BPO,并测得其相对分子质量为751Da;  (4)BPO能有效抑制体外培养的Hela细胞增殖,并具有浓度与时间依赖性;BPO可阻止Hela细胞G1期向S期的转化;BPO能促进caspase-3mRNA和caspase-10mRNA表达上调。  结论:BPO能诱导Hela细胞凋亡,其作用机制与诱导凋亡基因表达上调和细胞周期阻滞有关。
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