子痫前期(Pre-eclampsia,PE)仍是全球范围内导致孕产妇和围生儿高发病率和高死亡率的重大疾病之一,其发病率为5%~10%。关于PE病因学的研究层出不穷,但是其确切病因和发病机制至今仍未被完全阐明,也缺乏有效的预防和治疗手段。因此,不断挖掘PE的病因和发病机制有重要的意义。近年来,大量的证据表明母体对胎儿的免疫耐受失衡在PE的发病中起着重要作用,其中Treg(Regulatory T,Treg)细胞和Th17(T helper 17,Th17)细胞之间的免疫平衡对于免疫耐受的维持有重要作用。PE患者外周血和母胎局部均存在着Treg细胞数量减少和Th17细胞数量增多的现象,这使得Treg/Th17细胞免疫平衡向Th17细胞偏移。随着研究的深入,发现Treg细胞还具有可塑性,在适宜的条件下,Treg细胞可以向Th17细胞转化。CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞是新近发现的一种独特的T细胞亚群,该群细胞同时具有Treg细胞和Th17细胞的表型和功能特点。研究发现Treg细胞向Th17细胞转化过程中存在着中间型细胞的产生。PE中存在Treg/Th17细胞的免疫失衡,但其是否存在着Treg细胞向Th17细胞转化目前尚无文献报道。因此,本研究以CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞为研究切入点,以正常晚孕妇女为对照,检测PE患者外周循环中CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞的数量变化,分析CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞与Treg和Th17细胞数量变化的相关性,同时通过体外研究探讨Treg细胞向Th17细胞的病理性转化的影响因素,以期进一步完善PE的免疫学发病机制,为PE的治疗提供新的线索和思路。第一部分子痫前期患者外周血中CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞的数量变化研究目的:研究正常晚孕妇女和PE患者外周血中CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞的数量变化。方法:以正常妊娠(Normal pregnancy,NP)妇女为对照组,PE患者为病例组,分别采集NP组(n=40)和PE组(n=23)对象外周血(肝素抗凝),通过密度梯度离心法获取其外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),分别用CD4-FITC、Foxp3-APC和IL17A-PE-Cy7三种单克隆荧光抗体进行标记染色,采用流式细胞(Flow cytometry,FCM)技术检测两组外周血中CD4~+Foxp3+Treg细胞、CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞和CD4~+IL-17A+Th17细胞的数量变化。结果:与NP组比,PE组外周血中CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞百分比明显增加(P<0.01);CD4~+IL-17A+Th17细胞的百分比也明显增加(P<0.01);Treg/Th17比值明显降低(P<0.01);CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞占CD4~+Foxp3+Treg细胞和Th17细胞的比例均明显增加(P<0.01)。结论:正常晚孕妇女和PE患者外周血中均存在CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞,且PE患者外周血中CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞的数量较正常晚孕妇女明显增加。第二部分子痫前期患者CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞与Treg细胞和Th17细胞数量变化的相关性研究目的:比较NP组和PE组外周血中CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞与CD4~+Foxp3+Treg细胞和CD4~+IL-17A+Th17细胞间数量变化的相关性。方法:根据第一部分实验结果,采用Spearman相关性分析对NP组和PE组外周血中CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞与CD4~+Foxp3+Treg细胞和CD4~+IL-17A+Th17细胞的数量变化进行相关性分析。结果:PE组外周血中CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞与CD4~+Foxp3+Treg细胞间的数量变化有负相关性趋势(r=-0.365),但无明显统计学意义(P>0.05);NP组中CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞与Th17细胞间的数量变化呈正相关性,有统计学意义(r=0.604,P<0.05);这一相关性在PE组中更为明显(r=0.803,P<0.01);此外,NP组中CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞占CD4~+Foxp3+Treg细胞的比例与Th17细胞数量变化呈正相关性(r=0.397,P<0.01);PE患者中CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞占CD4~+Foxp3+Treg细胞的比例与Th17细胞数量变化的相关性更为明显(r=0.741,P<0.01)。结论:外周血中CD4~+Foxp3~+IL-17~+中间型细胞与Th17细胞的数量变化呈明显正相关,且在PE中其相关性更为明显。第三部分外周血中诱导Treg细胞向Th17细胞病理性转化的影响因素研究目的:探讨外周血中诱导Treg细胞向Th17细胞病理性转化的影响因素。方法:通过磁珠分选分离出NP妇女外周血中CD4~+CD25~+Treg细胞,采用含IL-6/IL-23/IL-1β细胞因子的培养基对CD4~+CD25~+Treg细胞进行体外刺激和培养,以模拟PE中高炎症环境,采用荧光定量PCR技术对细胞培养前后与Treg和Th17细胞功能有关的关键基因(如Foxp3、IL-10和ROR-γt和IL-17A)的m RNA进行检测,以探索外周血中诱导CD4~+CD25~+Treg细胞向Th17细胞病理性转化的影响因素。结果:用含IL-6/IL-23/IL-1β细胞因子的完全培养基培养后,CD4~+CD25~+Treg细胞中ROR-γt和IL-17A m RNA的相对表达量明显上升,IL-10 m RNA的相对表达量明显降低,而Foxp3 m RNA的相对表达量则无明显变化。结论:IL-6/IL-23/IL-1β能够诱导NP妇女外周血中CD4~+CD25~+Treg细胞向Th17细胞的转化。