壳聚糖酶是催化壳聚糖中β-1，4-糖苷键断裂的一类糖苷水解酶，由于其水解产物为壳寡糖而具有重要的应用潜能。目前研究者们发现了多种来源的壳聚糖酶，对其理化性质进行了广泛研究，并从中筛选到一些稳定性较好、活性较高的酶源，通过重组表达或优化发酵条件也能获得较高的产量，但对壳聚糖酶的水解模式及产物组成（聚合度、乙酰度）还缺乏深入研究，从而导致在生产上无法准确选择合适的壳聚糖酶来制备理想的壳寡糖。针对以上问题，本课题一方面从土壤中筛选壳聚糖酶产量较大、活性较高的新的微生物菌株，并探究所选菌株在农业生产上的应用;另一方面，对所选菌株的壳聚糖酶基因进行重组表达，以提高产量，同时深入研究催化机制，探讨结构与功能的关系，分析水解模式及产物分布，并通过蛋白质工程的方法进一步提高酶活性。取得成果如下:　　1、以壳聚糖作为唯一碳源，从土壤中筛选到15株具有壳聚糖酶分泌功能的菌株，其中MY001和MY002菌株的产酶活性较高，鉴定结果分别为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。　　2、从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）MY002菌株中克隆到壳聚糖酶基因，该酶属于糖苷水解酶46家族的B聚族。重组表达了MY002菌株壳聚糖酶不含信号肽的片段CsnMY002，它具有较高的表达量，在摇瓶培养下产量约100mg/L，纯化后的CsnMY002，在37℃、pH6.0的条件下酶活大小为507±23U/mg，且该酶的最适温度为50℃，最适pH为3.0。　　3、利用气相扩散法获得了CsnMY002蛋白质晶体，通过分子置换法解析了CsnMY002的三维结构，这是从GH46家族B聚族壳聚糖酶中获得的第一个晶体结构，它与GH46家族其他壳聚糖酶的整体结构相似，且催化残基高度保守，分别为Glu19和Asp35。但不同的是，CsnMY002在没有结合底物的情况下，底物结合区域呈闭合的“隧道”状。　　4、制备无活性的突变体E19A-CsnMY002结合底物(GlcN)6的复合物晶体，解析了E19A/(GlcN)6和E19A/(GlcN)4-(GlcN)4两个酶-底物复合物结构，将两者重合可以模拟得到E19A/(GlcN)9复合物。发现CsnMY002在结合底物前后结构并无明显变化，闭合的底物结合隧道最多可与6个葡萄糖胺产生直接的氢键相互作用，即-3～+3;在E19A/(GlcN)6结构中，底物位于-4～+2，只有5个糖单元与CsnMY002直接作用，而催化位点位于-1～+1之间，所以根据底物结合情况，可产生“G3+G3”的对称型和“G2+G4”的非对称型两种切割方式，且推测，由于“G3+G3”型底物与酶结合更加稳定而使这种切割模型优于“G2+G4”型切割。　　5、利用薄层层析法(TLC)分析CsnMY002的水解产物发现，水解(GlcN)6的初期产物产量分布为:G3＞＞G2＞G4，进一步验证了“G3+G3”型切割模式较“G2+G4”型占优势的推论。另外，该酶能快速降解聚合度＞4的壳寡糖及聚合度较低的壳聚糖，产生G2和G3，且对G2或G3具有微弱的降解能力，该酶对高聚合度的不可溶壳聚糖也有微弱的水解作用。　　6、对CsnMY002中一些关键氨基酸进行定点突变，这些突变体的酶活变化进一步证明了:Glu19和Asp35为催化残基;与底物相互作用的氨基酸对酶活性有重要的影响，且它们的作用会随着与切割位点间距离的减小而增大;特异性氨基酸序列(TRDEWR)对催化功能也具有重要作用，尤其是Thr200与Trp204;另外还获得了13个酶活性提升的突变体，其中E31A/E55A活性提升约33％。　　7、结合TLC、突变及结构分析，发现CsnMY002同其他壳聚糖酶一样，通过“反向”催化机制水解底物，Asp35作为广义碱亲核攻击一个关键的水分子，被激活的水分子再去攻击-1位点糖单元上的C1原子;与此同时，Glu19作为广义酸，从糖链的反向使-1和+1糖单元之间的糖苷氧质子化。同样地，Thr40帮助关键水分子向Asp35定位，Arg37通过与Asp35形成氢键来优化催化过程。　　8、综合复合物结构、TLC分析发现，CsnMY002空结构中底物结合裂缝呈闭合状态，与“非连续”型水解酶相似，但该酶底物结合隧道周围没有足够数量的芳香族氨基酸分布且水解产物并非以二糖为主，所以认为CsnMY002水解底物的方式类似于连续型水解酶的初始切割，底物分子从一侧进入隧道，但在第一次切割完成之后，底物会与酶分离，再重新进入隧道与酶结合，进行下一次的切割。　　9、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MY001菌株对固体几丁质具有一定的降解作用，并且单独使用MY001菌株或几丁质对天门冬拟茎点霉(Phomopsis aspasagi(Sacc.)Bubak)都具有拮抗作用，当联合施用几丁质及MY001菌株会产生更好的抗菌作用，这为芦笋茎枯病提供了新的生防途径。　　本研究主要获得两株具较高壳聚糖酶活性菌株，初步探究了MY001菌株的应用;重组表达MY002菌株的去信号肽壳聚糖酶CsnMY002，并结合蛋白质晶体学、定点突变、TLC等实验方法，研究了该酶的结构特点、催化机制、水解模式及水解产物分布等，同时筛选到酶活升高的突变体。这些工作对壳聚糖酶的工业化应用具有指导意义。