研究背景： 移植物抗宿主病(graft—versus—host disease，GVHD)是同种异体骨髓/造血干细胞移植(allo—BMT/SCT)最主要的并发症之一，严重影响着移植后的生存时间和生存质量。目前临床上GVHD的防治方法虽可将重症GVHD的发生率控制在35％以下，但也相应地带来了许多严重的副作用，包括严重的免疫抑制，致死性感染，白血病的复发等等，从而抵消了这些方法对原发病的治愈价值。因此，如何有效的防治GVHD，同时保留移植物抗感染和移植物抗白血病(graft—versus—leukemia, GVL)效应已经成为临床开展同种异体骨髓/造血干细胞移植和移植免疫耐受研究中亟需解决的问题。 抗原提呈细胞中的树突状细胞(DC)除可以激活T细胞产生免疫应答以外，也具有致免疫耐受的作用。DC按其来源可分为髓系DC(DC1)和淋巴系DC(DC2)；按其成熟程度可分为不成熟DC和成熟DC。成熟DC1具较强的免疫激活作用，而不成熟的DC1具有产生免疫耐受的作用，然而无论是不成熟还是成熟DC2均具有致免疫耐受作用。 制备DC主要采用CD34+的造血干细胞加细胞因子体外诱导的方法。本课题组采用新方法制备的小鼠优势不成熟CD8α+DC体外刺激同系淋巴细胞增殖的能力弱；对同系或同种异基因MLR有抑制作用；且体内有预防GVHD，防止白血病复发的作用。基于此研究结果进一步探讨优势不成熟CD8α+DC同种异体骨髓移植中的作用机制。 研究目的： 1、阐明优势不成熟CD8α+DC预防移植物抗宿主病(GVHD)的机制。 2、通过体外实验探究优势不成熟CD8α+DC在预防GVHD的同时是否保留移植物抗白血病(GVL)的效应。 3、探讨优势不成熟CD8α+DC在预防GVHD保留GVL效应的同时，是否具有移植物抗肿瘤(GVT)作用。 研究方法： BALB/c(H—2d)小鼠尾静脉输注2×106个红白血病鼠脾细胞/只，建立EL9611红白血病细胞体内传代的动物模型。 BALB/c(H—2d)小鼠脾细胞，EL9611(H—2d)红白血病细胞和C57BL/6(H—2b)小鼠前列腺癌细胞RM-1经反复冻融，超声裂解法提取细胞全抗原并测蛋白含量。 取C57BL/6(H—2b)小鼠的骨髓细胞，制备优势不成熟CD8α+DC和成熟DC，于培养最后一天加入制备好的各全抗原冲击DC。 抗原冲击后的各DC细胞分别与同系(H—2b)T细胞(1∶1，2∶1，4∶1)共培养，MTT法观察T细胞增殖情况。收集共培养上清，ELISA法检测上清中细胞因子的含量。根据T细胞增殖情况和细胞因子分泌情况探索最佳的杀伤实验条件。 抗原冲击后的优势不成熟CD8α+DC细胞刺激同系T细胞活化增殖，LDH释放法检测T细胞的杀伤功能。 研究结果： 1、小鼠骨髓细胞以4×106/ml的培养密度，5ng/ml GM—CSF,20ng/ml IL—4，100ng/ml SCF和25ng/ml Flt3L的细胞因子组合，诱导第3天后产生的DC，CD8α+DC/总DC比例为91.52％，不成熟CD8α+DC/总DC的比例为62.43％。细胞表面低表达MHCⅡ，几乎不表达协同刺激分子CD40、CD86，为优势不成熟CD8α+DC。 2、BALB/c小鼠脾细胞抗原冲击后优势不成熟CD8α+DC与T细胞比例为1:1时，不能有效的刺激T细胞增殖。这与对照组的成熟DC相比有统计学差异。两组MLR上清中细胞因子分泌情况明显不同，优势不成熟CD8α+DC组IL-10的分泌明显高于成熟DC组。杀伤实验结果显示，效靶比为1:1时，抗原特异性T细胞即能产生明显的杀伤作用，且Ag冲击浓度为5ug/ml杀伤率可达70％。 3、EL9611红白血病细胞抗原冲击后优势不成熟CD8α+DC随着与T细胞比例的增加，刺激增殖的作用呈梯度上升。各比例组与成熟DC相应比例组大致一致。细胞因子检测发现IL-10的分泌和优势不成熟CD8α+DC刺激T细胞的增殖活性存在密切的关系。特异性杀伤实验显示，CTL对EL9611白血病细胞(效靶比1:1)杀伤作用显著，冲击浓度为2.5ug/ml时杀伤率即可达80％。非特异性杀伤实验显示，CTL对BALB/c脾细胞未见明显杀伤作用，杀伤率低于T细胞阴性对照。 4、C57BL/6小鼠前列腺癌细胞抗原冲击后优势不成熟CD8α+DC与T细胞共培养的结果和EL9611白血病细胞抗原冲击后的结果相似。随predo—iDC/T细胞比例增加，刺激增殖的作用呈梯度上升。各比例组与成熟DC的相应比例组相比T细胞增殖情况相当。两组细胞因子分泌情况相似。杀伤实验结果显示，随Ag冲击浓度增加杀伤作用增强，当冲击浓度为5ug/ml时，杀伤率可达70％。 结论： 1、采用5ng/ml GM—CSF，20ng/ml IL—4，100ng/ml SCF和25ng/ml Flt3L的细胞因子组合体外短期诱导(诱导第3天)小鼠骨髓细胞制备优势不成熟CD8α+DC的方法重复性高，稳定性好，可用于移植免疫的动物实验和临床研究，为科学研究和临床应用提供坚实的基础。 2、同种异基因抗原冲击后的优势不成熟CD8α+DC不能有效的刺激同系T细胞的增殖，进一步证实了优势不成熟CD8α+DC具有预防GVHD的作用。 3、同种异基因白血病抗原冲击后的优势不成熟CD8α+DC显著的刺激同系T细胞的增殖，表明优势不成熟CD8α+DC可以保留GVL效应。 4、同系恶性肿瘤抗原冲击后的优势不成熟CD8α+DC显著的刺激同系T细胞的增殖，提示优势不成熟CD8α+DC可以起到移植物抗肿瘤(GVT)的作用。