【摘 要】
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膜蛋白约占整个基因组的30％并承担很重要的细胞生物学功能,但是膜蛋白三维结构的解析依然是结构生物学家面临的一大难题,在膜蛋白表达或纯化过程中存在着重重困难。在此,我们
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膜蛋白约占整个基因组的30％并承担很重要的细胞生物学功能,但是膜蛋白三维结构的解析依然是结构生物学家面临的一大难题,在膜蛋白表达或纯化过程中存在着重重困难。在此,我们描述了一个以大肠杆菌为基础的膜蛋白高通量表达纯化流程。高通量克隆用的是不依赖于连接的克隆(LIC),在载体的碳末端(C端)融合有绿色荧光蛋白(GFP)用于高通量表达筛选,在经过荧光读值及胶内荧光两种方法筛选后,应用LIC的方法将蛋白克隆到只带组氨酸(His)标签的载体上以便进行大量纯化。在筛选到高表达的蛋白以后,用热稳定性实验筛选缓冲液和去污剂,以找到最佳组合进行膜蛋白大量纯化及晶体筛选。我们应用此流程成功的进行了大肠杆菌膜蛋白实验,可以将其扩展到其他原核生物。
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